Определение активности пероксидазы
Экстракты размораживают, в случае наличия возможного осадка центрифугируют при 12 000 мин-1 в течение 10 мин и после предварительного разбавления определяют в них концентрацию белка одним из описанных в разделе 3.3 методов, а также пероксидазную активность.
В спектрофотометрическую кювету (l = 1 см) помещают реакционную смесь, содержащую:
· 2,3 мл раствора белка;
· 0,1 мл 1%-ного спиртового раствора субстрата.
Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 1,66 М раствора Н2О2. Общий объем пробы составляет 2,5 мл. Содержимое кюветы перемешивают и измеряют изменение экстинкции раствора в течение 45−60 с на спектрофотометре Specord M-40 с помощью специальной кинетической программы. Измерения проводят при длине волны, которая позволяет регистрировать изменение экстинкции вещества, имеющего хромофорные группы. Такими веществами в реакциях окисления о-дианизидина и гваякола являются продукты реакции, а конифериловый спирт сам выступает в роли соединения, обладающего характерным спектром поглощения в УФ-области.
Таким образом, для о-дианизидина и гваякола регистрируется скорость образования продукта реакции при длине волны 460 и 470 нм соответственно, а для кониферилового спирта – скорость превращения самого субстрата при длине волны 260 нм. С помощью программного обеспечения прибора проводится расчет величины начальной скорости реакции – тангенса угла наклона касательной к кинетической кривой в нулевой точке (изменение экстинкции в секунду E/S).
Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение E/S.
Величину удельной пероксидазной активности вычисляют по следующей формуле:
(4.10)
где АП – удельная пероксидазная активность, мкмоль/(мин · мг белка); n – стехиометрический коэффициент для субстрата в реакции пероксидазного окисления (n = 2 для о-дианизидина, n = 4 для гваякола, n = 1 для кониферилового спирта); E/S – изменение экстинкции в единицу времени, с-1; 60 – количество секунд в 1 мин; V1 – объем инкубационной смеси, мл; С – концентрация белка, мг/мл; V2 – объем внесенного раствора белка, мл; e − коэффициент молярной экстинкции продукта или субстрата реакции, М-1 · см-1 (для реакции с о-дианизидином e = 30 000 М-1 · см-1; для реакции с гваяколом e = 26 000 М-1 · см-1; для кониферилового спирта e = 17 000 М-1 · см-1); l – толщина кюветы, см; 103 – количество миллилитров в 1 л; 65,2 · 103 – коэффициент пересчета, учитывающий известные величины.
В связи с тем, что концентрация концентрированной перекиси водорода точно не известна, при ее разбавлении концентрацию раствора определяют спектрофотометрически при 230 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 72,7 М-1 · см-1. В 3%-ном растворе Н2О2 концентрация равна 1,121 М.
Вопросы для самоконтроля
1. Что собой представляют ферменты и какими свойствами они обладают?
2. Приведите классификацию ферментов. Как образуются систематические названия ферментов?
3. Дайте определение понятия «изоферменты». Приведите примеры.
4. Что собой представляет активный центр фермента? Какую функцию он выполняет?
5. Чем обусловлена специфичность ферментов? Перечислите виды специфичности, дайте им характеристику.
6. За счет чего ферменты увеличивают скорость реакций?
7. Объясните причины высокой кататалитической активности ферментов.
8. Что такое кофакторы ферментов? Чем отличаются коферменты и простетические группы? Приведите примеры.
9. Перечислите основные механизмы, согласно которым кофакторы принимают участие в катализе.
10. Дайте характеристику переносчикам восстановительных эквивалентов. Приведите примеры реакций, в которых они функционируют.
11. Что понимают под активностью фермента? В каких единицах ее выражают?
12. Чем обусловлено изменение активности фермента при изменении температуры и рН среды?
13. Что изучает ферментативная кинетика? Как измеряют скорость ферментативной реакции?
14. Перечислите основные факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции. Каков характер зависимости скорости ферментативной реакции от этих факторов?
15. При каких условиях достигается максимальная скорость ферментативной реакции? Какая модель описывает такую кинетику и в чем состоит ее суть?
16. Каков физический смысл константы Михаэлиса КМ?
17. Какие методы применяют для линеаризации уравнения Михаэлиса - Ментен?
18. Объясните характер действия обратимых и необратимых ингибиторов на активность ферментов.
19. В результате чего снижается активность ферментов в случае конкурентного, неконкурентного или бесконкурентного ингибирования? Как это выражается графически?
20. Почему для определения активности ферментов наиболее предпочтительны спектрофотометрические методы? На чем они основаны?
21. Охарактеризуйте периодические и непрерывные методы измерения активности ферментов. Что необходимо учитывать при выборе условий измерения активности ферментов?
22. К какому классу ферментов относится алкогольдегидрогеназа, какую реакцию она катализирует, какое вещество является кофактором этого фермента?
23. В чем состоит принцип метода определения активности алкогольдегидрогеназы?
24. Каковы особенности выделения пероксидазы из биологического материала и определения ее активности?