Определение активности пепсина

Ферменты пищеварительного тракта, ускоряющие переваривание белков, жиров и углеводов пищи, относятся к классу гидролаз. Ферменты, принимающие участие в расщеплении белков в желудочно-кишечном тракте, относятся к подклассу пептид-гидролаз. Особенностью пепсина является то, что он максимально активен в резко кислой среде (оптимум рН 1,0-2,0).

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Створаживание молочно-ацетатной смеси при рН 4,9 и температуре 25 ºС пепсином происходит в соответствии с его способностью переваривать белки. За единицу активности пепсина принимают такое его количество, которое при указанных условиях створаживает 5 мл молочно-ацетатной смеси за 1 мин (эта условная единица соответствует 0,01 мг кристаллического пепсина). В норме желудочный сок человека содержит в 1 мл 40-60 ед. пепсина.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) ацетатный буфер с рН 4,9; 2) молочно-ацетатная смесь; 3) раствор пепсина или желудочный сок; 4) пробирки, пипетки, секундомер.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку №1 помещают 1 мл желудочного сока (или раствора пепсина).

В пробирку №2 – 3 мл молочно-ацетатной смеси и прогревают 5 минут при 25 ºС. Затем быстро переливают молочно-ацетатную смесь в первую пробирку и включают секундомер. Как только на стенках пробирки появятся первые хлопья казеина, останавливают секундомер. Для расчета активности пепсина в 1 мл число 60 делят на количество секунд – получают количество единиц пепсина в 1 мл желудочного сока.

Например, 40 ед. соответствует 0,4 мг кристаллического пепсина.

Результат занести в таблицу 12.

Таблица 12

Фермент Субстрат Реакция, катализируемая ферментом Время действия Количество пепсина в 1мл
           

Лабораторная работа №17

ДЕЙСТВИЕ ПЕПСИНА НА БЕЛОК ФИБРИН

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Протеолитическую активность пепсина наблюдают, добавив к его подкисленному раствору небольшое количество фибрина. Фибрин, нерастворимый в воде, под действием пепсина гидролизуется до растворимых в воде пептидов.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) 1 % раствор препарата пепсина в 0,2 % растворе HCl; 2) фибрин; 3) водяная баня; 4) пробирки; 5) пипетки; 5) термометр.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку №1 приливают 15 капель или 0,5 мл раствора пепсина, в пробирку №2 – такое же количество предварительно прокипяченного раствора пепсина. В каждую пробирку опускают небольшой кусочек фибрина. Обе пробирки помещают в водяную баню при температуре 38 оС на 60 минут. Наблюдают растворение фибрина.

Результаты занести в таблицу 13.

Таблица 13

Фермент Субстрат Изменение субстрата ВЫВОД
           

Лабораторная работа №18

ОБНАРУЖЕНИЕ КАТАЛАЗЫ В КРОВИ

По химической природе каталаза является геминферментом. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду: 2Н2О2 → О2↑ + 2Н2О

Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода, образующейся в организме во время течения окислительно-восстановительных процессов.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Об активности каталазы крови судят по бурному выделению пузырьков кислорода при добавлении перекиси водорода к капле крови.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) кровь; 2) Н2О2, 1 % раствор; 3) штатив с пробирками; 4) капельницы.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку наливают 10-15 капель 1 % раствора Н2О2 и добавляют каплю крови. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение пузырьков кислорода.

Результат занести в таблицу 14.

Таблица 14

Фермент Субстрат Реакция, катализируемая ферментом Выявление действия фермента
             

Лабораторная работа №19

ДЕЙСТВИЕ ЛИПАЗЫ НА ЖИРЫ

Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира. У человека она содержится в небольшом количестве в желудке; главным же образом липаза входит в состав сока поджелудочной железы. Желудочная липаза может действовать только на предварительно эмульгированные жиры, например на жир молока.

В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов и тем самым активируют действие липазы поджелудочной железы.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Липазу открывают, добавив ее раствор к молоку, подщелоченному раствором карбоната натрия до бледно-розовой окраски на фенолфталеин. В присутствии липазы происходит гидролитическое расщепление жира молока на глицерин и жирные кислоты, реакция среды сдвигается в кислую сторону, розовая окраска исчезает.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) вытяжка из препарата поджелудочной железы или 5 % раствор панкреатина; 2) сухие сливки, 5 % раствор; 3) фенолфталеин, 1 % спиртовой раствор; 4) карбонат натрия, 1 % раствор; 5) бюретки; 6) пробирки; 7) пипетки; 8) водяная баня; 9) термометры.

ХОД РАБОТЫ:

В 2 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 5 % раствора сухих сливок. В пробирку №1 добавляют 5 капель вытяжки из поджелудочной железы или раствор панкреатина, содержащий липазу. В пробирку №2 добавляют такое же количество воды. В обе пробирки приливают по 1 капле 1 % раствора фенолфталеина и по каплям 1 % раствор карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски (нельзя добавлять избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38 оС на 30 минут. Наблюдают изменение окраски.

Результаты занести в таблицу 15.

Таблица 15

Фермент Субстрат Окраска на фенолфталеин ВЫВОД
исходная конечная
             

Лабораторная работа №20

Наши рекомендации