Продукции методом формольного титрования

Аминокислоты – это первичные азотистые вещества растений, в молекулах которых имеются карбоксильные и аминные группировки, соединенные с органическим радикалом алифатической, ароматической или гетероциклической природы. У боль­шинства из них аминогруппа присоединена к α-углеродному атому. Однако известны также некоторые аминокислоты, у которых аминогруппа связана с другими углеродными атомами (_b, γ, d и др.).

Подавляющее большинство природных аминокислот синте­зируется в организмах в виде L-форм, а D-формы аминокислот встречаются редко, чаще всего в клетках микроорганизмов. При химическом синтезе образуется рацемическая смесь L- и D-форм аминокислот. Ферментные системы растений, человека и животных специ­фически приспособлены катализиро-вать биохимические реакции, происходящие с участием L-форм амино-кислот, и не способны к превращениям D-форм, которые даже могут ингибировать биохимические процессы в организме. Только метионин может усваиваться организмами человека и животных как в L-форме, так и D-форме.

Важнейшая биологическая роль аминокислот – участие в синтезе белковых молекул. Аминокислоты, участвующие в синтезе белков, принято называть протеиногенными, их насчитывается 18. Кроме того, в синтезе белков принимают участие два амида – аспара­гин и глутамин. Включение указанных аминокислот, а также аспарагина и глутамина в белковые полипептиды определяется кодонами генетического кода. После синтеза белковой молекулы в ней могут про­исходить модификации радикалов некоторых аминокислот, поэтому при анализе состава белков, кроме протеиногенных, обнаруживают некоторые другие аминокислоты (оксипролин, оксилизин и др.).

Наряду с аминокислотами важную роль в обмене азотистых веществ организмов играют некоторые иминокислоты (пролин, пипеколиио­вая кислота и др.), содержащие вторичную аминную группировку (═NH). Они близки по физико-химическим свойствам к истинным аминокислотам и выполняют сходные биологические функции.

Важные функции в растительном организме выполняют производные аминокислот – амиды и бетаины, из которых наиболее хорошо изучены аспарагин, глутамин и гликоколбетаин. Аспарагин и глутамин участвуют в построении белковых молекул, являются продуктами обмена многих азотистых веществ. Гликоколбетаин ─ продукт азотного обмена у некоторых растений, служит активным донором метильных групп.

Аминокислоты, не участвующие в синтезе белков, являются важными метаболитами, с участием которых происходит синтез протеиногенных аминокислот, а также всех других азотистых ве­ществ растительного организма: нуклеотидов, амидов, азотистых оснований, алкалоидов, некоторых липидов, многих витаминов, хлорофилла, фитогормонов (ауксинов, цитокининов), некоторых фитонцидов.

Растения и природные формы микроорганизмов способны син­тезировать все необходимые им аминокислоты из других органи­ческих веществ, тогда как организмы человека и животных не спо­собны к синтезу некоторых протеиногенных аминокислот. Эти аминокислоты называют незаменимыми и они должны посту­пать в организм с пищей.

Для взрослого человека незаменимыми являются 8 аминокислот: лизин, триптофан, метионин, треонин, лейцин, валин, изолейцин, фенилала-нин. Для детей и некоторых групп животных незаменимыми также являются аргинин, гистидин и цистеин. При недостатке незаменимых аминокислот в организмах ослабляется синтез белков, что может быть причиной тяжелых заболеваний. А их недостаток в растительных кормах снижает выход животно­водческой продукции в расчёте на единицу массы затраченного корма, в результате чего повышается её себестоимость.

В целях составления правильного пищевого рациона для каж­дого вида организмов с учётом возрастного и физического состо­яния определены ежедневные нормы потребления незаменимых аминокислот. Чаще всего в кормах сельскохозяйственных животных в недоста­точном количестве содержатся такие незаменимые аминокислоты, как лизин, триптофан и метионин.

Содержание свободных аминокислот в растениях зависит от вида органа или ткани, возраста растений, внешних условий и особенно подвержено большим изменениям в зависимости от интенсивности протекания тех биохимических процессов, которые сопряжены с их потреблением (синтез белков, нуклеиновых кислот и других азотис­тых веществ). Более высоким содержанием свободных аминокислот отличается сочная растительная продукция – клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса кормовых трав. В указанных растительных продуктах на долю небелковых азотистых веществ, основную часть которых составляют аминокислоты, приходится 40-60% от общего количества азотистых веществ.

Концентрация аминокислот повышается при ослабле­нии ростовых процессов, недостатке питательных элементов, избы­точном азотном питании, усилении процессов распада белков при старении растений или прорастании семян. Концентрации отдельных аминокислот могут возрастать в ре­зультате метаболитных нарушений в организме и под воздействием стрессов. Так, например, при вододефицитном стрессе в клетках растений происходит накопление аминокислоты пролина, а при избыточном аммонийном питании – накопление аспарагина, глутамина и аргинина.

Как было отмечено ранее (стр. 6-7), аминокислоты довольно легко вступают в реакции с редуцирую­щими сахарами, образуя при этом темноокрашенные продукты – меланоидины, которые могут ухудшать качество и товарные свойства растительной продукции.

В результате ферментативного окисления ароматических амино­кислот тирозина и фенилаланина также образуются темноокрашен­ные продукты – меланины, вызывающие потемнение на воздухе очищен­ных клубней картофеля, измельченных корнеплодов, овощей и фрyктoв. Эти вещества совместно с меланоидинами определяют тёмный цвет ржаного хлеба и вызывают потемнение макарон при сушке.

Меланины синтезируются в ходе окислительной конденсации пирокатехина и диоксифенилаланина (ДОФА), который образуется при окислении ароматических аминокислот тирозина и фенилаланина под действием фермента тирозиназы. На следующем этапе ДОФА, подвергаясь реакциям окисления, декарбоксилирования и циклизации, превращается в 5,6-диоксииндол и в индол-5,6-хинон. А последние вступают в реакции конденсации между собой и с молекулами пирокатехина. В результате щелочного гидролиза растительные меланины распадаются на пирокатехин, протокатеховую и салициловую кислоты, а также образуется небольшое количество 5,6-диоксииндола.

Аминокислоты, содержащиеся в растительном сырье, являются источниками образования вредных побочных продуктов в бродильном производстве – сивушных масел, которые представляют собой спирты (изоамиловый, изобутиловый, н-пропиловый), возникающие при дезаминировании и декарбоксилировании валина, лейцина, изолейцина, треонина. В сахарном производстве аминокислоты усиливают образование мелассы, в результате чего уменьшается выход сахара из корнеплодов сахарной свёклы.

Принцип метода.При взаимодействии аминокислот с формальдеги-дом происхо­дит связывание молекул формальдегида с их аминными группами, а карбоксильные группы остаются свободными, в связи с чем получен­ные соединения можно оттитровать раствором щёлочи.

По количе­ству щелочи, затраченной на титрование, затем определяют количе­ственное содержание аминокислот в растворе. Для моноаминомоно-карбоновых кислот количество титруемых карбоксильных групп эквивалент-но числу связанных формальдегидом аминных групп. Для того чтобы ввести поправку на число дополнительных карбоксильных групп у дикарбоновых аминокислот, полученный раствор после добавления формальдегида предварительно нейтрализуют до рН = 7,0.

Оборудование.Лабораторные весы, колбы на 150 мл, мерные цилиндры на 10 и 50 мл, фарфоровые ступки диаметром 10 см с пестиками, фарфоровые чашки диаметром 8-10 см, марлевая ткань для фильтрования экстракта аминокислот, встряхиватель, микробюретка, стеклянные стаканы на 100 мл, пипетки на 1 мл, мерные колбы на 100, 200, 250 мл и на 1 л.

Реактивы.Гидроксид натрия кристаллический или в фиксанале, концентрированная соляная кислота (1,19 г/см³), фенолфталеин, бромтимол синий, 40% раствор формалина, борная кислота, хлористый калий, дистилли-рованная вода, 96% этиловый спирт.

Приготовление растворов.0,05 М раствор NaOH: готовится из фикса-нала путём разбавления дистиллированной водой (не содержащей СО₂) в мерной колбе на 1 л.

0,05 М раствор HCl: готовится в мерной колбе на 1 л при растворении в воде 4,12 мл концентрированной соляной кислоты.

0,5% раствор фенолфталеина: 0,5 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 50% этилового спирта.

0,04% раствор бромтимола синего: 0,1 г бромтимола синего измельчают в ступке и растворяют с 3,2 мл 0.05 М раствора NaOH, после чего полученную смесь количественно переносят дистиллированной водой в мерную колбу на 250 мл и доводят объём раствора в колбе до метки.

0,2 М раствор NaOH: 2 г NaOH растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 250 мл.

Формольная смесь: в колбе с пробкой смешивают 50 мл 40% раствора формалина с 2 мл 0,5% спиртового раствора фенолфталеина; полученную смесь титруют 0,2 М раствором NaOH до слаборозового окрашивания (несколько капель) и затем фильтруют. Формольная смесь готовится каждые 3 дня и должна иметь слаборозовую окраску, которую при необходимости восстанавливают добавлением 1-2 капель 0,2 М раствора NaOH. Раствор формалина для нейтрализации кислотности обрабатывают в течение суток порошком мела, после чего осадок мела удаляют фильтрованием.

Буферный раствор с рН = 9,2: 12,4 г Н₃ВО₃ и 14,9 г KCl растворяют в 26,7 мл 0,2 М раствора NaOH в мерной колбе на 200 мл и доводят объём раствора в колбе до метки дистиллированной водой.

0,2 М раствор КН₂РО₄: 5,444 г КН₂РО₄ растворяют в 200 мл дистиллированной воды.

Буферный раствор с рН = 7,0: в мерной колбе на 200 мл смешивают 50 мл 0,2 М раствора КН₂РО₄ и 29,1 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объём раствора в колбе дистиллированной водой до метки.

Ход определения.5 г размолотого высушенного растительного материала помещают в коническую колбу на 150 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды, закрывают пробку и встряхивают на встряхивателе в течение 30 минут. Затем полученную смесь переносят в фарфоровую чашку на марлю, уложенную в 4 слоя, и отжимают в чашку растительный экстракт, содержащий свободные аминокислоты.

При анализе сочного растительного материала (клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды) взвешенную растительную пробу растирают в фарфоровой ступке пестиком с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы, после чего приливают 50 мл дистиллированной воды и интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Растительный экстракт по выше указанной методике отжимают через 4 слоя марли в фарфоровую чашку.

Для проведения формольного титрования в стаканчике на 100 мл смешивают 2 мл растительного экстракта, содержащего свободные аминокислоты, с 18 мл дистиллированной воды и 5 каплями раствора бромтимола синего. Если полученная смесь имеет синюю окраску, её осторожно по каплям нейтрализуют 0,05 М раствором HCl, а если жёлтую окраску – 0,05 М раствором NaOH до образования жёлто-зелёного окрашивания (рН = 7,0). При этом добиваются получения такой интенсив-ности окрашивания, как и в контрольной пробе, которую готовят в отдельном стаканчике на 100 мл, приливая в него 20 мл буферного раствора с рН = 7,0 и 5 капель раствора бромтимола синего.

В нейтрализованную до рН = 7,0 смесь приливают из мерного цилиндра 2 мл формольного реактива и титруют опытную пробу 0,05 М раствором NaOH до образования сине-фиолетового окрашивания, сравнивая интенсивность окрашивания с цветом контрольной пробы, которую готовят в отдельном стаканчике на 100 мл, приливая в него 20 мл буферного раствора с рН = 9,2, 5 капель раствора бромтимола синего и 3 капли 0,5% спиртового раствора фенолфталеина. Для введения поправки в отдельном стаканчике на 100 мл смешивают 20 мл дистиллированной воды, 5 капель раствора бромтимола синего и 3 капли 0,5% спиртового раствора фенолфталеина и полученную смесь титруют 0,05 М раствором NaOH.

Если экстракт аминокислот бесцветный и прозрачный, объём экстракта для формольного титрования можно увеличить до 5-10 мл.

Обработка и оценка результатов.Содержание азота аминокислот в растительной пробе вычисляют по следующей формуле:

(V₁ - V₂) ∙ 0,7 ∙ 50 ∙ 100

СА = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ ,

Н ∙ 2

где СА – содержание азота аминокислот в растительной пробе, мг%;

V₁ – объём 0,05 М раствора NaOH, затраченный на титрование опытной пробы, мл;

V₂ – объём 0,05 М раствора NaOH, затраченный на титрование 20 мл воды, мл;

0,7 – коэффициент пересчёта на азот аминокислот, мг;

50 – общий объём экстракта аминокислот, полученный из растительной пробы, мл;

100 – коэффициент пересчёта на 100 г растительной пробы;

Н – навеска растительной пробы, г;

2 – объём экстракта аминокислот, взятый для формольного титрования, мл.

Полученный результат сравнивается с литературными данными и результатами анализа других растительных образцов. На основе рассчитанного показателя делается вывод о содержании свободных аминокислот в анализируемой растительной пробе и направленности происходящих в ней биохимических процессов.

Контрольные вопросы

1. Какие стереоизомеры аминокислот синтезируются в живых организмах?

2. В чём состоят структурные и биологические особенности протеино­генных аминокислот?

3. Что выражает понятие "незаменимые амино­кислоты"?

4. Какие образуются продукты при взаимо­действии аминокислот с редуцирующими сахарами и как они влияют на товарные свойства растительной продукции?

5. Какие образуются продукты при взаимо­действии аминокислот с кислородом воздуха и как они влияют на товарные свойства растительной продукции?

6. Какие вредные побочные продукты образуются из аминокислот в бродильном производстве?

7. В чём состоит принцип определения аминокислот методом формольного титрования?

8. Как получают экстракт свободных аминокислот из растительной пробы?

9. Каковы особенности формольного титрования экстракта аминокис-лот, выделенного из растительной пробы?

10. Как производится расчёт содержания аминокислот в растительной пробе?

11. В зависимости от каких факторов изменяется концентра­ция аминокислот в растительных тканях?