Определение свободных аминокислот в растительной продукции методом формольного титрования
Вводные пояснения. Аминокислоты - это первичные азотистые вещества растений, в молекулах которых имеются карбоксильные и аминные группировки, соединенные с органическим радикалом алифатической, ароматической или гетероциклической природы. У большинства из них аминогруппа присоединена к α-углеродному атому. Однако известны также некоторые аминокислоты, у которых аминогруппа связана с другими углеродными атомами (β-, γ-, δ- и др.).
Подавляющее большинство природных аминокислот синтезируется в организмах в виде L-форм, а D-формы аминокислот встречаются редко, чаще всего в клетках микроорганизмов. При химическом синтезе образуется рацемическая смесь L- и D-форм аминокислот. Ферментные системы растений, человека и животных специфически приспособлены катализировать биохимические реакции, происходящие с участием L-форм аминокислот, и не способны к превращениям D-форм, которые даже могут ингибировать биохимические процессы в организме. Только метионин может усваиваться организмами человека и животных как в L-форме, так и D-форме.
Важнейшая биологическая роль аминокислот - участие в синтезе белковых молекул. Аминокислоты, участвующие в синтезе белков, принято называть протеиногенными, их насчитывается 18. Кроме того, в синтезе белков принимают участие два амида - аспарагин и глутамин. Включение указанных аминокислот, а также аспарагина и глутамина в белковые полипептиды определяется кодонами генетического кода. После синтеза белковой молекулы в ней могут происходить модификации радикалов некоторых аминокислот, поэтому при анализе состава белков, кроме протеиногенных, обнаруживают некоторые другие аминокислоты (оксипролин, оксилизин и др.).
Наряду с аминокислотами важную роль в обмене азотистых веществ организмов играют некоторые иминокислоты (пролин, пипеколиновая кислота и др.), содержащие вторичную аминную группировку (=NH). Они близки по физико-химическим свойствам к истинным аминокислотам и выполняют сходные биологические функции.
Важные функции в растительном организме выполняют производные аминокислот – амиды и бетаины, из которых наиболее хорошо изучены аспарагин, глутамин и гликоколбетаин. Аспарагин и глутамин участвуют в построении белковых молекул, являются продуктами обмена многих азотистых веществ. Гликоколбетаин – продукт азотного обмена у некоторых растений, служит активным донором метильных групп.
Аминокислоты, не участвующие в синтезе белков, являются важными метаболитами, с участием которых происходит синтез протеиногенных аминокислот, а также всех других азотистых веществ растительного организма: нуклеотидов, амидов, азотистых оснований, алкалоидов, некоторых липидов, многих витаминов, хлорофилла, фитогормонов (ауксинов, цитокининов), некоторых фитонцидов.
Растения и природные формы микроорганизмов способны синтезировать все необходимые им аминокислоты из других органических веществ, тогда как организмы человека и животных не способны к синтезу некоторых протеиногенных аминокислот. Эти аминокислоты называют незаменимыми и они должны поступать в организм с пищей. Для взрослого человека незаменимыми являются 8 аминокислот: лизин, триптофан, метионин, треонин, лейцин, валин, изолейцин, фенилаланин. Для детей и некоторых групп животных незаменимыми также являются аргинин, гистидин и цистеин. При недостатке незаменимых аминокислот в организмах ослабляется синтез белков, что может быть причиной тяжелых заболеваний. А их недостаток в растительных кормах снижает выход животноводческой продукции в расчете на единицу массы затраченного корма, в результате чего повышается ее себестоимость.
В целях составления правильного пищевого рациона для каждого вида организмов с учетом возрастного и физического состояния определены ежедневные нормы потребления незаменимых аминокислот. Чаще всего в кормах сельскохозяйственных животных в недостаточном количестве содержатся такие незаменимые аминокислоты, как лизин, триптофан и метионин.
Содержание свободных аминокислот в растениях зависит от вида органа или ткани, возраста растений, внешних условий и особенно подвержено большим изменениям в зависимости от интенсивности протекания тех биохимических процессов, которые сопряжены с их потреблением (синтез белков, нуклеиновых кислот и других азотистых веществ). Более высоким содержанием свободных аминокислот отличается сочная растительная продукция - клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса кормовых трав. В указанных растительных продуктах на долю небелковых азотистых веществ, основную часть которых составляют аминокислоты, приходится 40-60% от общего количества азотистых веществ.
Концентрация аминокислот повышается при ослаблении ростовых процессов, недостатке питательных элементов, избыточном азотном питании, усилении процессов распада белков при старении растений или прорастании семян. Концентрации отдельных аминокислот могут возрастать в результате метаболитных нарушений в организме и под воздействием стрессов. Так, например, при вододефицитном стрессе в клетках растений происходит накопление аминокислоты пролина, а при избыточном аммонийном питании – накопление аспарагина, глутамина и аргинина.
Аминокислоты довольно легко вступают в реакции с редуцирующими сахарами, образуя при этом темноокрашенные продукты - меланоидины, которые могут ухудшать качество и товарные свойства растительной продукции. В результате ферментативного окисления ароматических аминокислот тирозина и фенилаланина также образуются темноокрашенные продукты - меланины, вызывающие потемнение на воздухе очищенных клубней картофеля, измельченных корнеплодов, овощей и фруктов. Эти вещества совместно с меланоидинами определяют темный цвет ржаного хлеба и вызывают потемнение макарон при сушке.
Меланины синтезируются в ходе окислительной конденсации пирокатехина и диоксифенилаланина (ДОФА), который образуется при окислении ароматических аминокислот тирозина и фенилаланина под действием фермента тирозиназы. На следующем этапе ДОФА, подвергаясь реакциям окисления, декарбоксилирования и циклизации, превращается в 5,6-диоксииндол и в индол-5,6-хинон. А последние вступают в реакции конденсации между собой и с молекулами пирокатехина. В результате щелочного гидролиза растительные меланины распадаются на пирокатехин, протокатеховую и салициловую кислоты,а также образуется небольшое количество 5,6-диоксииндола.
Аминокислоты, содержащиеся в растительном сырье, являются источниками образования вредных побочных продуктов в бродильном производстве - сивушных масел, которые представляют собой спирты (изоамиловый, изобутиловый, н-пропиловый), возникающие при дезаминировании и декарбоксилировании валина, лейцина, изолейцина, треонина. В сахарном производстве аминокислоты усиливают образование мелассы, в результате чего уменьшается выход сахара из корнеплодов сахарной свеклы.
Принцип метода. При взаимодействии аминокислот с формальдегидом происходит связывание молекул формальдегида с их аминными группами, а карбоксильные группы остаются свободными, в связи с чем полученные соединения можно оттитровать раствором щелочи.
По количеству щелочи, затраченной на титрование, затем определяют количественное содержание аминокислот в растворе. Для моноаминомонокарбоновых кислот количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно числу связанных формальдегидом аминных групп. Для того чтобы ввести поправку на число дополнительных карбоксильных групп у дикарбоновых аминокислот; полученный раствор после добавления формальдегида предварительно нейтрализуют до pH = 7,0.
Оборудование. Лабораторные весы, колбы на 150 мл, мерные цилиндры на 10 и 50 мл, фарфоровые ступки диаметром 10 см с пестиками, фарфоровые чашки диаметром 8-10 см, марлевая ткань для фильтрования экстракта аминокислот, встряхиватель, микробюретка, стеклянные стаканы на 100 мл, пипетки на 1 мл, мерные колбы на 100, 200, 250 мл и на 1 л.
Реактнвы. Гидроксид натрия кристаллический или в фиксанале, концентрированная соляная кислота (1,19 г/см3), фенолфталеин, бромтимол синий, 40% раствор формалина, борная кислота, хлористый калий, дистиллированная вода, 96% этиловый спирт.
Приготовление растворов. 0,05 М раствор NaOH: готовится из фиксанала путем разбавления дистиллированной водой (не содержащей СО2) в мерной колбе на 1 л (2 г гидроксида натрия на 1 л воды).
0,05 М раствор НС1: готовится в мерной колбе на 1 л при растворении в воде 4,12 мл концентрированной соляной кислоты.
0,5% раствор фенолфталеина: 0,5 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 50% этилового спирта.
0,04% раствор бромтимола синего: 0,1 г бромтимола синего измельчают в ступке и растворяют с 3,2 мл 0,05 М раствора NaOH, после чего полученную смесь количественно переносят дистиллированной водой в мерную колбу на 250 мл и доводят объем раствора в колбе до метки.
0,2 М раствор NaOH: 2 г NaOH растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 250 мл.
Формольная смесь: в колбе с пробкой смешивают 50 мл 40% раствора формалина с 2 мл 0,5% спиртового раствора фенолфталеина; полученную смесь титруют 0,2 М раствором NaOH до слаборозового окрашивания (несколько капель) и затем фильтруют. Формольная смесь готовится каждые 3 дня и должна иметь слаборозовую окраску, которую при необходимости восстанавливают добавлением 1-2 капель 0,2 М раствора NaOH. Раствор формалина для нейтрализации кислотности обрабатывают в течение суток порошком мела, после чего осадок мела удаляют фильтрованием.
Буферный раствор с pH = 9,2: 12,4 г Н3ВО4 и 14,9 г КСl растворяют в 26,7 мл 0,2 М раствора NaOH в мерной колбе на 200 мл и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.
0,2 М раствор KH2PО4: 5,444 г KH2PО4 растворяют в 200 мл дистиллированной воды.
Буферный раствор с pH = 7,0: в мерной колбе на 200 мл смешивают 50 мл 0,2 М раствора КН,Р04 и 29,1 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем раствора в колбе дистиллированной водой до метки.
Ход определения. 5 г размолотого высушенного растительного материала помещают в коническую колбу на 150 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды, закрывают пробку и встряхивают на встряхивателе в течение 30 минут. Затем полученную смесь переносят в фарфоровую чашку на марлю, уложенную в 4 слоя, и отжимают в чашку растительный экстракт, содержащий свободные аминокислоты.
При анализе сочного растительного материала (клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды) взвешенную растительную пробу растирают в фарфоровой ступке пестиком с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы, после чего приливают 50 мл дистиллированной воды и интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Растительный экстракт по выше указанной методике отжимают через 4 слоя марли в фарфоровую чашку.
Для проведения формольного титрования в стаканчике на 100 мл смешивают 2 мл растительного экстракта, содержащего свободные аминокислоты, с 18 мл дистиллированной воды и 5 каплями раствора бромтимола синего. Если полученная смесь имеет синюю окраску, ее осторожно по каплям нейтрализуют 0,05 М раствором НС1, а если желтую окраску - 0,05 М раствором NaOH до образования желто-зеленого окрашивания (pH = 7,0). При этом добиваются получения такой интенсивности окрашивания, как и в контрольной пробе, которую готовят в отдельном стаканчике на 100 мл, приливая в него 20 мл буферного раствора с pH = 7,0 и 5 капель раствора бромтимола синего.
В нейтрализованную до pH = 7,0 смесь приливают из мерного цилиндра 2 мл формольного реактива и титруют опытную пробу 0,05 М раствором NaOH до образования сине-фиолетового окрашивания, сравнивая интенсивность окрашивания с цветом контрольной пробы, которую готовят в отдельном стаканчике на 100 мл, приливая в него 20 мл буферного раствора с pH = 9,2, 5 капель раствора бромтимола синего и 3 капли 0,5% спиртового раствора фенолфталеина. Для введения поправки в отдельном стаканчике на 100 мл смешивают 20 мл дистиллированной воды, 5 капель раствора бромтимола синего и 3 капли 0,5% спиртового раствора фенолфталеина и полученную смесь титруют 0,05 М раствором NaOH.
Если экстракт аминокислот бесцветный и прозрачный, объем экстракта дня формольного титрования можно увеличить до 5-10 мл.
Обработка и оценка результатов. Содержание азота аминокислот в растительной пробе вычисляют по следующей формуле:
где СА – содержание азота аминокислот в растительной пробе, мг%;
V1 – объем 0,05 М раствора NaOH, затраченный на титрование опытной пробы, мл;
V2 – объем 0,05 М раствора NaOH, затраченный на титрование 20 мл воды, мл;
0.7 – коэффициент пересчета на азот аминокислот, мг;
50 – общий объем экстракта аминокислот, полученный из растительной пробы, мл;
100 – коэффициент пересчета на 100 г растительной пробы;
Н – навеска растительной пробы, г;
2 – объем экстракта аминокислот, взятый для формольного титрования, мл.
Полученный результат сравнивается с литературными данными и результатами анализа других растительных образцов. На основе рассчитанного показателя делается вывод о содержании свободных аминокислот в анализируемой растительной пробе и направленности происходящих в ней биохимических процессов.
Контрольные вопросы
1. Какие стереоизомеры аминокислот синтезируются в живых организмах?
2. В чем состоят струюурные и биологические особенности протеиногенных аминокислот?
3. Что выражает понятие «незаменимые аминокислоты»?
4. Какие образуются продукты при взаимодействии аминокислот с редуцирующими сахарами и как они влияют на товарные свойства растительной продукции?
5. Какие образуются продукты при взаимодействии аминокислот с кислородом воздуха и как они влияют на товарные свойства растительной продукции?
6. Какие вредные побочные продукты образуются из аминокислот в бродильном производстве?
7. В чем состоит принцип определения аминокислот методом формольного титрования?
8. Как получают экстракт свободных аминокислот из растительной пробы?
9. Каковы особенности формольного титрования экстракта аминокислот, выделенного из растительной пробы?
10. Как производится расчет содержания аминокислот в растительной пробе?
11. В зависимости от каких факторов изменяется концентрация аминокислот в растительных тканях?