Опыт 3. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака
Лабораторная работа «Холестерин»
Цели и задачи: изучить основные функции и пути обмена холестерина в организме, провести определение содержания общего холестерина в сыворотке крови.
Студент должен:
- знать: химическую природу и строение холестерина, содержание холестеина в тканях, функции холестерина в организме, сущность понятий «гиперхолестеринемия» и «гипохолестеринемия»;
- уметь: проводить выделение липидов из тканей, осуществлять их идентификацию химическими методами, количественно определять концентрацию общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака, пользоваться калибровочным графиком;
- владеть: методикой проведения экстракции, приемами работы с фотоэлектроколориметром, методикой сбора и анализа данных эксперимента.
Оборудование и реактивы: пробирки, мерные цилиндры, пипетки аналитические, колба круглодонная, обратный холодильник, воронки, фильтровальная бумага, фотоэлектроколориметр, мозг, гипс, хлороформ, этанол, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, смесь формалина с концентрированной серной кислотой, насыщенный спиртовой раствор хлорида кадмия, сыворотка крови, ледяная уксусная кислота, рабочий раствор хлорида железа, стандартный раствор холестерина.
Опыт 1. Выделение холестерина из тканей головного мозга.
Тщательно растирают в ступке 5 г мозга и 10 г гипса. Полученную массу намазывают на стеклянную пластину и сушат в сушильном шкафу при 600С. Сухую массу счищают с пластинки и растирают в ступке. Переносят в сухую пробирку, приливают 6 мл хлороформа, взбалтывают 10 минут. Экстракт отфильтровывают в сухую пробирку.
Опыт 2. Качественные реакции на холестерин.
Реакция Шиффа.
В пробирку наливают 1 мл хлороформного раствора холестерина и осторожно по стенке подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе раздела жидкостей появляется кольцо красного цвета.
Реакция Сальковского.
Жидкость после проведения пробы Шиффа встряхивают. После расслаивания верхний слой окрашивается в красный цвет, нижний имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуоресценцией.
Реакция Либермана – Бурхарда.
В пробирку наливают 1 мл хлороформного раствора холестерина, добавляют 0,5 мл уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Хорошо перемешивают. Образуется красная окраска, переходящая в фиолетовую, затем синюю и зеленую. При незначительном содержании холестерина может сразу появиться зеленая окраска.
Реакция Витта.
К 2 мл хлороформного раствора холестерина приливают равный объем смеси формалина с серной кислотой и взбалтывают. Образуется 2 слоя: верхний – вишневого цвета и нижний – буро-красный с интенсивной зеленой флуоресценцией. Сливают верхний (хлороформный) слой в другую пробирку и добавляют 2-3 капли уксусного ангидрида. Окраска переходит в синюю.
Цветные реакции на холестерин обусловлены дегидратацией и окислением холестерина под действием концентрированной серной кислоты и последующей конденсацией продуктов с образованием соединений с сопряженными двойными связями, дающими с серной кислотой различные окрашенные производные.
Опыт 3. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис – Зака.
Метод основан на реакции холестерина с уксусной и серной кислотами в присутствии хлорида железа. Вероятно, происходит дегидратация холестерина и его окисление.
К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорида железа, перемешивают. Готовят контроль: к 0,1 мл дистиллированной воды прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорида железа. Оставляют на 15 минут.
Колориметрируют против контроля на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.
Из стандартного раствора холестерина готовят разведения, как указано в таблице.
Таблица.
| № пробирок | Стандартный раствор холестерина, мл | Ледяная уксусная кислота, мл | Рабочий раствор хлорида железа, мл | Содержание холестерина в пробе, мг% |
| 0,1 | 3,0 | 2,0 | ||
| 0,2 | 3,0 | 2,0 | ||
| 0,3 | 3,0 | 2,0 | ||
| 0,4 | 3,0 | 2,0 | ||
| 0,5 | 3,0 | 2,0 |
Через 20 минут пробы фотометрируют против контроля. По результатам строят калибровочный график. По калибровочному графику определяют содержание холестерина в сыворотке крови. Норма содержания холестерина в сыворотке крови – 120-250 мг% (3,12-6,50 ммоль/л).