Ферментный метод определения нерастворимых и растворимых пищевых волокон
Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из продуктов растительного происхождения. Метод позволяет определить растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.
Реактивы: спирт этиловый и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/дм3; панкреатин; глюкоамилаза очищенная; гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ; протеаза № Р-3910 или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности (пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи).
Аппаратура, материалы: весы аналитические, баня водяная, шкаф сушильный, стаканы химические, стеклянный пористый фильтр № 100, № 40 или обеззоленный фильтр
4.7.1Подготовка образцов к испытанию. Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице, просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более 1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или в микроизмельчителе тканей.
При содержании жира в образцах более 5% проводят обезжиривание. Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе образца), периодически перемешивают в течение 15 минут и затем отстаивают не менее 1 минуты, прозрачный раствор петролейного эфира декантируют и повторяют экстракцию с темже количеством эфира 2 раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.
4.7.2. Проведение испытаний. 0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с погрешностью не более 0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 см3 дистиллированной воды при 40 оС в течение 1,5 ч.
Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин при условии, что температура суспензии достигает 90 оС.
После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают рН 1,5±0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М, добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна 5´10-3 ПЕНВ) и ставят на инкубацию при температуре 40 оС в течение 1,0-1,5 ч при периодическом помешивании.
Смесь охлаждают до комнатной температуры, устанавливают рН 6,8±0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3М и приливают 10 см3 0,05 М раствора пакреатина. Смесь инкубируют в течение 1,0-1,5 ч при помешивании при температуре 40 оС.
Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают 1,0 см3 водного раствора глюкоамилазы концентрацией 50 мг/см3 (рекомендуется использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г крахмала), устанавливают рН 4,8±0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М и инкубируют при температуре 40оС в течение 12 ч.
Полноту гидролиза крахмала проверяют йодной пробой. Для этого несколько капель вышеуказанной смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы (приливают к смеси 5 см3 водного раствора глюкоамилазы концентрацией 5 мг/см3 и инкубиркют 1 ч при рН 4,8±0,1 и температуре 60оС).
Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр №100 или предварительно высушенный и взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна, оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 см3 70% раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 см3 ацетона в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным. Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105±1оС и высушивают до постоянной массы.
Фильтрат делят на две равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые волокна 4-кратным количеством 96% этилового спирта, взятого к объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10-12 ч, затем фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр № 40 ( при необходимости используют слабый вакуум) до получения прозрачного фильтрата. Осадок на фильтре промывают последовательно 25 см3 70% раствора этилового спирта и 25 см3 ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 105±1 оС до постоянной массы.
В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и золы методом озоления.
Для корректировки данных проводят контрольный опыт без навески образца.
Содержание пищевых волокон в продуктах определяют по следующим формулам.
Для нерастворимых пищевых волокон:
Х1 = 
; (4.16)
для растворимых пищевых волокон:
Х2 = 
, (4.17)
где Х1 – содержание нерастворимых пищевых волокон, г на 100 г продукта; Х2 – содержание растворимых пищевых волокон, г на 100 г продукта; m – навеска образца продукта, г; m1 и m 3 – масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых волокон после высушивания соответственно, г; m 2 – масса остатка в контрольном опыте после высушивания, г; В – содержание белка в препарате пищевых волокон, г; С – содержание золы в препарате пищевых волокон, г (возможно использование табличных данных).
Общее содержание пищевых волокон (Х) вычисляют суммированием величин Х1 и Х2.
За окончательный результат определения массовой доли нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Определение проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.
Вопросы для контроля
1. Перечислите основные методы определения сахаров.
2. На чем основано определение сахарозы в продуктах?
3. В чем сущность определения редуцирующих сахаров методом Бертрана? При исследовании каких продуктов его используют?
4. Какими методами можно определить лактозу в молоке?
5. На чем основано качественное открытие крахмала в продуктах?
6. В чем сущность цианидного метода определения крахмала?
7. На чем основано определение нерастворимых и растворимых пищевых волокон в продуктах?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ