Тема : аминокислотный состав белков
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1
ОПЫТ 1.ГИДРОЛИЗ БЕЛКА
Принцип метода. Анализ аминокислотного состава белка проводят после его гидролиза кислотой или щелочью. Пептидная связь является ковалентной и химически устойчивой, поэтому гидролиз проводят в жестких условиях.
Ход работы. При проведении кислотного гидролиза белок кипятят в растворе 6 М НСl при 105° С в течение 24 час. в запаяных ампулах под вакуумом.
Образовавшийся гидролизат используют в дальнейших опытах.
ОПЫТ 2. РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Цель работы: Анализ гидролизата белка методом бумажной хроматографии в присутствии маркеров. Определение коэффициента распределения аминокислот.
Принцип метода. Это метод распределительной хроматографии. Основан на различии растворимости аминокислот в двух несмешивающихся жидкостях: вода (неподвижная фаза, так как зафиксирована на хроматографической бумаге ) и органический растворитель ( фенол, изобутиловый или бутиловый спирт). Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от степени их растворимости в подвижной и неподвижной фазах и может характеризоваться величиной Rf .
Rf = а / b ,
где а - расстояние, пройденное аминокислотой. b - расстояние, пройденное растворителем.
Коэффициент Rf является величиной, характерной для каждой аминокислоты и постоянной при данных условиях опыта.
Бумажная хроматография бывает восходящая, нисходящая и круговая. Для быстрого разделения аминокислот можно использовать метод круговой хроматографии на бумаге.
Ход работы. Диск хроматографической бумаги радиусом 9-10 см разделить на 4 сектора путем сгибания. Из середины диска провести карандашом окружность радиусом 1 см. На середину каждой полученной дуги нанести 1 каплю (0,002 мл) раствора гидролизата или аминокислоты и высушить на воздухе. Диск поместить между двумя половинками чашки Петри, нижняя из которых наполовину заполнена растворителем. Сделать из фильтровальной бумаги фитилек и вставить его верхний конец в центр хроматографического диска, а нижний поместить в расворитель. Когда граница растворителя достигнет краев чашки Петри, хроматографическую бумагу снимают и высушивают при 70-80° С для удаления растворителя.
Для окрашивания хроматограмму быстро проводят через ванночку с раствором нингидрина и высушивают при 80-100° С в сушильном шкафу. На хроматорамме появляются окрашенные пятна на месте аминокислот.
Результаты:______________
Выводы:__________________
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2.
ТЕМА: КАЧЕСТВЕННЫЕ ( ЦВЕТНЫЕ) РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
Цветные реакции на белки являются реакциями на функциональные группы радикалов аминокислот, входящих в состав белков.
ОПЫТ1 . ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРА ЯИЧНОГО АЛЬБУМИНА
Цель метода: Анализ растворов на принадлежность к белковым веществам и сравнение их по аминокислотному составу.
Принцип метода: Яичный белок – это 10%-водный раствор нескольких белков без заметных примесей углеводов и липидов. Альбумин в яичном белке составляет 70% и легко отделяется путем 10-кратного разведения дистиллированной водой.
Ход работы: 20 мл яичного белка разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10 при постоянном помешивании стеклянной палочкой. Яичный альбумин остается в растворе, а белки глобулиновой фракции выпадают в виде хлопьевидного осадка, который отфильтровывают через бумажный фильтр.
Результат: Полученный раствор яичного альбумина используют в дальнейших опытах.
ОПЫТ №2. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип метода: Пептидные группы белков и пептидов (- СО - NH- ) в щелочной среде образуют комплексные соединения с ионами меди (Сu2+ ). Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Далее в каждую пробирку добавляют по 3 капли NaOH и по 1 капле CuSO4. Пробирки встряхивают. Наблюдают за изменением окраски.
Результаты: I пробирка_________________________________
II пробирка _________________________________________________
III пробирка__________________________________________________
Выводы____________________________________________
ОПЫТ 3. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА АЛЬФА-АМИНОГРУППЫ
Принцип метода: Нингидрин вступает в реакцию с концевыми α-аминогруппами белков, пептидов или аминокислот. Продукты этой реакции окрашены в сине- фиолетовй цвет.
Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую-5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора нингидрина. Кипятят 2 минуты на водяной бане. Следят за изменением окраски.
Нингидриновая реакция применяется для обнаружения белков, пептидов и аминокислот в растворах.
Результаты:
I пробирка_______
II пробирка _____
III пробирка_____
Выводы___________________
ОПЫТ 4. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИКЛИЧЕСКИЕ АМИНОКИСЛОТЫ
Принцип метода: Радикалы аминокислот, имеющие в своем составе бензольное кольцо (фен, тир, трп) вступают с азотной кислотой в реакцию нитрования. Продукты реакции окрашены в желтый цвет.
Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Затем в каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты (HNO3 – агрессивная жидкость!). Кипятят 2 минуты на водяной бане. Регистрируют изменение цвета.
Результаты:
I пробирка_______
II пробирка _____
III пробирка_____
Выводы___________________
ОПЫТ 5. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА НА ТИРОЗИН
Принцип метода: Фенол с солями ртути дает красное окрашивание. Тирозин, имеющий фенольную группу в радикале, также дает красное окрашивание при реакции с солями ртути.
Ход работы Берут четыре пробирки: в первую вносят 10 капель раствора белка, во вторую – 10 капель гидролизата, в третью – 10 капель желатина, в четвертую – 10 капель раствора фенола. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Миллона (смесь солей ртути в концентрированной азотной кислоте). Кипятят 5 минут. Регистрируют изменение окраски.
Результаты:
I пробирка_______
II пробирка _____
III пробирка_____
IV пробирка_____
Выводы___________________
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
ТЕМА: ФИЗИКО – ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
ОПЫТ № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНА ИЗ МОЛОКА
Принцип метода: В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор. 80% всех белков молока приходится на долю казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении казеин выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые фильтрованием отделяются от раствора.
Ход работы: В стакан ( 50 мл ) отмеряют 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. После перемешивания добавляют 10 мл 1% HCl, т.к. в избытке соляной кислоты осадок казеина растворяется. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут до образования рыхлого осадка.
Для удаления соляной кислоты в стакан приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. Процедуру повторяют. Осадок фильтруют через бумажный фильтр.
ОПЫТ № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ КАЗЕИНА
Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами, поэтому диссоциируют с образованием как положительно, так и отрицательно заряженных групп. При определении pH среды можно добиться такого соотношения ионизированных групп, при котором белковый раствор наименее устойчив и белок выпадает в осадок.
Ход работы: В 5 пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую – 0,25 мл; во вторую – 0,5 мл; в третью – 1,0 мл; в четвертую – 2,0 мл; в пятую – 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл; 8,5 мл; 8,0 мл; 7,0 мл и 5,0 мл воды.
В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора.
| № п/п | Реактив | |||||
| 0,1 н. р-р CH3COOH | 0,25 | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 4,0 | |
| Вода | 8,75 | 8,5 | 8,0 | 7,0 | 5,0 | |
| 0,4% р-р казеина | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| pH | ||||||
| Степень помутнения |
Результаты:______________
Выводы___________________
ОПЫТ №3. ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
3.1. Осаждение белков при кипячении.
Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если pH раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.
Ход работы. В 5 пробирок вносят по 5 капель раствора яичного белка. Затем добавляют:
во вторую пробирку – 1 каплю уксусной кислоты;
в третью – 10 капель уксусной кислоты;
в четвертую – 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлорида натрия;
в пятую – 2 капли гидроксида натрия.
Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане.
Результаты:
| № пробирки | Реакция среды | Наличие факторов стабилизации | |||
| Гидратная оболочка (есть/нет) | Заряд (есть «+» или «-»/ нет) | ||||
| 1. | Нейтральная | ||||
| 2. | Слабокислая | ||||
| 3. | Сильнокислая | ||||
| 4. | Кислая + электролит | ||||
| 5. | Щелочная |
Выводы:__________________
3.2. Осаждение белка ацетоном
Ход работы. В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 0,5 мл ацетона, осторожно наслаивая по стенке пробирки.
Результаты:______________
Выводы:__________________
3.3. Осаждение белков спиртом
Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, добавляют несколько кристаллов хлорида натрия (NaCl ) и приливают 5 мл этилового спирта.
Результаты:______________
Выводы:__________________
3.4. Осаждение белка органическими кислотами
Принцип метода: органические кислоты, такие как трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, вызывают денатурацию и осаждение белка.
Ход работы: В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 3 – 4 капли 8% трихлоруксусной кислоты (CCl3COOH ).
Результаты:______________
Выводы:__________________
3.5. Осаждение белка концентрированной азотной кислотой
Принцип метода: Концентрированная азотная кислота вызывает денатурацию белка и его осаждение. Осадок белка не растворяется в избытке азотной кислоты.
Ход работы: В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты, затем осторожно из пипетки наслаивают по стенке пробирки примерно 1 мл раствора белка так, чтобы жидкости не смешивалтсь.
Результаты:______________
Выводы:__________________
3.6. Осаждение белка солями тяжелых металлов
Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, осторожно, по каплям при встряхивании добавляют раствор сульфата меди (CuSO ).
Результаты:______________
Выводы:__________________
ОПЫТ № 4. ФРАКЦИОННОЕ ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ
Принцип метода:
Ход работы: К 1 мл неразбавленного яичного белка добавляют 6 мл воды. Образунтся небольшое количество белого хлопьевидного осадка глобулинов. Глобулины могут растворяться в слабых растворах солей и не растворяются в дистиллированной воде.
В пробирку наливаем несколько капель насыщенного раствора (NH4)2SO4, после чего происходит растворение выпавшего глобулина.
К 1 мл данного раствора яичного белка. Содержащего альбумины и глобулины приливаем 1 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4. Выпадает осадок глобулинов. Который удаляется фильтрованием.
К фильтрату добавляем кристаллический сульфат аммония до полного насыщения. Образуется осадок яичного альбумина. Который всплывает вверх вследствие высокой плотности жидкости. Осаждение белков солями является обратимым процессом и при добавлении воды белки снова растворяются.
Результаты опыта и выводы оформляют в виде таблицы:
| Название белка | Степень насыщения (NH4)2SO4 | Результаты опыта | Выводы |
| Яичный белок | 50% | ||
| Яичный белок | 100% |
ОПЫТ № 5. ДИАЛИЗ БЕЛКОВ
Принцип метода: Очень удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например от избытка солей после высаливания, является диализ.
Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и т.д.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора яичного альбумина и прибавляют к раствору 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, переносят в пробирку и растворяют физиологическим раствором.
Из листа целлофана, предварительно смоченного дистиллированной водой, делают мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки.
Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывая палочки, зажимающие мешочек, на края стакана. Необходимо проследить за тем, чтобы уровень жидкости в мешочке был ниже уровня жидкости в стакане.
Через 1 час после диализа берут в две пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:
а) на присутствие SO42- : добавляют в первую пробирку 3 – 4 капли 5%-ного раствора BaCl2 .
б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию.
Жидкость из мешочка сливают в пробирку ( диализат), отмеривают 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.
Результаты:______________
Выводы:__________________