Определение активности полифенолоксидазы

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ

Объект:листья или корни высших растений.

Цель работы: определить активность пероксидазы (ПО) в гетеротрофных и автотрофных тканях; сравнить активность пероксидазы у разных видов высших растений.

Ход работы:

Навеску растительного материала 50–100 мг (необходимо точно записать массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М фосфатного буфера, рН 6,7. Растёртую массу количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают и оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения активности фермента.

Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 440 нм. При окислении некоторых фенолов (например, гваякола) пероксидазой образуется окрашенный продукт и оптическая плотность раствора при 440 нм увеличивается. Реакция, проходящая в реакционной среде:

пероксидаза
фенол + Н₂О₂ ——————> хинон+ 2Н₂О

Для измерения оптической плотности используют три кюветы по 8 мл (контроль и две химические повторности). В каждую из трёх кювет вносят:

2 мл вытяжки,

2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 6,7,

2 мл гваякола.

После этого в контрольную кювету вносят 2 мл дистиллированной воды, устанавливают её внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Ручками грубой и точной настройки нуля устанавливают "0"оптической плотности по контрольной кювете.

Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 0,3% раствора перекиси водорода и одновременно включают секундомер. Записывают значения оптической плотности через каждые 5 (–20–60) секунд. Необходимо снять 5–10 точек. Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.

Строят график зависимости оптической плотности D₄₄₀ от времени t. На графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической плотности D’₄₄₀ = (D₄₄₀²– D₄₄₀¹) / (t²– t¹). (D’₄₄₀вычисляется по численным значениям, а не измеряется по графику!)

Активность пероксидазы А_ПО рассчитывают по формуле:

D^’ * N (ед. опт. плотн.)

А_ПО = —————— [——————————]

m_сыр. * l_кюв. (г сыр.массы) * (сек)

D’₄₄₀ – скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]

N – разведение

m_сыр. – сырая масса навески [г]

l_кюв. – толщина кюветы [см] (l_кюв. = 2 см)

В выводах указать рассчитанную активность фермента, сравнить активность фермента в разных органах / видах / условиях выращивания растений, объяснить возможные причины различий на основе сведений о функциях фермента в растении.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ

Объект: листья или корни высших растений.

Цель работы:определить активность полифенолоксидазы (ПФО) в гетеротрофных и автотрофных тканях; сравнить активность полифенолоксидазы у разных видов высших растений.

Ход работы:

Навеску растительного материала 250–500 мг (необходимо точно записать массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,0–7,4. Растёртую массу количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают и оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения активности фермента.

Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 590 нм. При окислении фенолов полифенолоксидазой в присутствии диэтилпарафенилендиамина образуется окрашенный продукт и оптическая плотность при 590 нм увеличивается. Реакции, проходящие в реакционной среде:

	+	О₂	полифенолоксидаза —————————>		+	2 Н₂О
пирокатехин				ортохинон
	+		—————————>		+
ортохинон		парафенилен- диамин		пирокатехин		окрашенный продукт

2 мл вытяжки,

2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,0 –7,4,

2 мл 0,02% раствора диэтилпарафенилендиамина.

Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 1% раствора пирокатехина и одновременно включают секундомер. Записывают значения оптической плотности через каждые 5 (–20–60) секунд. Необходимо снять 5–10 точек. Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.

Строят график зависимости оптической плотности D₅₉₀ от времени t. На графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической плотности D’₅₉₀ = (D₅₉₀² – D₅₉₀¹) / (t² – t¹). (D’₅₉₀вычисляется по численным значениям, а не измеряется по графику!)

Активность полифенолоксидазыА_ПФО рассчитывают по формуле:

D^’ * N (ед. опт. плотн.)

А_ПФО = —————— [——————————]

m_сыр. * l_кюв. (г сыр.массы) * (сек)

D’₅₉₀ – скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]

N – разведение

m_сыр. – сырая масса навески [г]

l_кюв. – толщина кюветы [см] (l_кюв. = 2 см)

Литература:

Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. – М.: Издательский центр "Академия", 2005 или 2007:

· реакция сверхчувствительности – с. 464-465, 617-619;

· вторичный метаболизм – с. 588-593;