Ориентировочная основа деятельности студентов для проведения лабораторной работы: Определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Принцип метода. Ферментативный метод определения глюкозы основан на действии глюкозооксидазы и предназначен для специфического определения глюкозы в биологических жидкостях в присутствии различных сахаров и других редуцирующих веществ неуглеводной природы. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам (кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется при действии фермента с образованием Н₂О₂ и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют реакцией, катализируемой ферментом пероксидазой, с последующим окислительным азосочетанием производного фенола с 4-аминофеназоном (хромогенный кислородный акцептор). В ходе реакции образуются окрашенные в розовый цвет продукты. Количественное определение глюкозы заключается в измерении интенсивности окраски красителя и сравнении оптической плотности испытуемой пробы с окраской калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно - хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37^оС

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта) : А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального содержанию глюкозы в крови с данными, полученными в результате проделанной работы.

Клинико-диагностическое значение. Благодаря существованию сложных регуляторных механизмов, концентрация глюкозы в крови сохраняется относительно постоянной – 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови зависит от строгой регуляции интенсивности процессов распада и синтеза гликогена, глюконеогенеза, скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и окисления ее в тканях с высвобождением энергии.

Гипогликемия – понижение содержания глюкозы в крови. Гипогликемия наблюдается при длительном голодании; сопровождает заболевания поджелудочной железы, опухолевый рост, тяжелые поражения печени, эндокринные нарушения; наблюдается при передозировке инсулина. При гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает риск развития гипогликемической комы.

Гипергликемия– повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.

Глюкозотолерантныйтест

( метод«сахарной нагрузки» или построение «сахарных кривых»)

Принцип метода: Глюкозотолерантный тест – оценка углеводного обмена, основанная на определении уровня глюкозы в крови натощак и после нагрузки. Тест позволяет выявлять скрытые формы сахарного диабета и нарушение толерантности к глюкозе.

Порядок выполнения работы:

1. Первоначально определяют концентрацию глюкозы в крови натощак

Проведение глюкозотолерантного теста возможно только при условии, что результат исследования глюкозы натощак не превышает 6,7 ммоль/л. Подобное ограничение связано с повышением риска возникновения гипергликемической комы при нагрузке.

2. Пациент употребляет около 75 г глюкозы, которая растворена в 200 мл воды (из расчета 1 г/кг массы тела).

3. Через 30, 60, 90 и 120 минут после нагрузки проводят забор крови и определяют концентрацию глюкозы.

4. Результаты определения используются дл построениягликемическихкривых:

У здорово­го человека после приема глюкозы на­блюдается увеличение ее содержания в крови, которое между 30-й и 60-й минутой достигает максимальной ве­личины. Затем начинается снижение и к 120-й минуте содержание глюкозы достигает исходного уровня, отмечавшегося натощак или с небольшими отклонениями в сторону, как повышения, так и снижения. Через 3 ч со­держание сахара в крови достигает исходной цифры. У больных сахарным диабетом отмечается повы­шенный исходный уровень глюкозы и высокая гипергликемия (свыше 8 ммоль/л) уже через час после сахарной нагрузки. Уровень глюкозы остается высоким (свыше 6 ммоль/л) в течение всего второго часа и к концу исследования (через 3 ч) не возвращается к исходному уровню. Одновременно отмечается глюкозурия.

Интерпретация результатов глюкозотолерантного теста:

Время	Концентрация глюкозы в крови
Толерантностьв норме	Толерантность снижена	Сахарный диабет
Натощак	Норма	< 6,7 ммоль/л	³ 6,7 ммоль/л
Через 1 час после нагрузки	Концентрация глюкозы увеличивается на 30-40%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%
Через 2 часа после нагрузки	Концентрация глюкозы приходит в норму	7,8 – 10,0 ммоль/л	³ 11,1 ммоль/л
Глюкозурия	нет	может быть	есть

Повышение толерантности наблюдается при:

· низкой скорости всасывания глюкозы в ЖКТ, обусловленной его заболеваниями;

· гипотиреозе; гипофункции надпочечников;

· избыточной секреции инсулина поджелудочной железой.

Понижение толерантности наблюдается при:

· неспособности организма утилизировать глюкозу (сахарный диабет);

· тиреотоксикозе; гиперфункции надпочечников (стероидный диабет);

· поражении гипоталамической области;

· беременности;

· общей интоксикации при инфекционных заболеваниях;

· поражении почек.

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время:

1. Назовите основные регуляторные механизмы, участвующие в обмене углеводов.

2. В чем проявляется влияние инсулина на обмен углеводов?

3. Как действуют на обмен углеводов адреналин, глюкагон, АКТГ, глюкокортикоиды?

4. Дайте характеристику гипергликемии, глюкозурии, гипоглике­мии.

5. Каковы основные причины сахарного диабета?

6. Назовите биохимические изменения при сахарном диабете.

7. Почему при лечении сахарного диабета введение инсулина рекомендуется сочетать с глюкозой?

Учебно-материальное обеспечение:

1. Химическая посуда, реактивы

2. Кровь (имитация)

3. ФЭК (фотоэлектроколориметр)

Литература:

а) обязательная

1. Биологическая химия: Учебник/Е.С, Северин, Т.Л. Алейникова и др.- М.: ООО

« Медицинское информационное агентство», 2008. - 368 с.

2. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. - М.: «ГЭОТАР-МЕД», 2003 – 784 с.

3. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева, 3 изд. - М.: «ГЭОТАР», 2005 – 441 с.

4. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник/Под ред. Е.С.Северина.- М.: «ГЭОТАР», 2008 – 384 с.

5. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник/Под ред. Е.С.Северина.- М.: «ГЭОТАР», 2011 – 624 с.

6. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.:«Медицинское информационное агентство». – 2004. -566 с.

7. Щербак И.Г. Биологическая химия: Учебник. – СПб.: «Издательство СПбГМУ», 2005. – 480 с.

б) дополнительная

1. Хасина М.А. Словарь-справочник по клинической биохимии – Владивосток: «Медицина ДВ», 2008.

2. Интернет-ресурсы(http://www.biblioclub.ru/. http://www.studmedlib.ru/и др.).

Практическое занятие № 18

Тема:« Регуляция уровня глюкозы в крови. Контроль знаний по модулю»

Мотивация:Научиться применять знания о свойствах углево­дов, их синтезе, метаболизме, о взаимосвязи этих процессов и механизмах регуляции при последующем изучении метаболизма органов и систем, а также для решения вопросов диагностики, профилактики и лечения болезней, связан­ных с нарушением обмена углеводов. Знакомство с процессом гликолиза дает представление о возможностях энергетического обеспечения клеток в анаэробных условиях. Важную роль в регуляции уровня глюкозы играют процессы синтеза и распада гликогена, глюконеогенез. Недостаточность ряда ферментов ПФП — причина гемолиза эритроцитов. Будущему специалисту необходимо четко представлять, как протекает метаболизм фруктозы и галактозы у человека, поскольку недостаточная активность ферментов, участвующих в обмене этих гексоз, приводит к таким заболеваниям, как идиопатическая фруктозурия и галактоземия. Знание особенностей обмена этанола в организме необходимо для понимания патогенеза алкоголизма и основных подходов к его терапии. Важную роль в регуляции уровня глюкозы играют процессы синтеза и распада гликогена. Концентрация глюкозы в крови поддерживается на постоянном уровне и находится под строгим гормональным контролем. В связи с этим, патологические изменения со стороны эндокринной системы нередко сопровождаются нарушением углеводного обмена. Так, недостаток инсулина приводит к сахарному диабету и гипергликемии.

Общая цель: полученные по данной теме знания формируют общекультурные и профессиональные компетенции (ПК-3, ПК-15), необходимые в последующем для изучения вопросов профессиональной направленности.

Конкретные цели и задачи.Сформировать знания о структуре углеводов животных тканей и растительных углеводов пищи. Сформировать представление об особенностях переваривания углеводов, транспорта глюкозы в клетки. Усвоить анаэробные процессы окисления глюкозы и их значение. Сформировать представление о путях превращения глюкозы в клетках в зависимости от энергетического статуса и особенностей окислительного метаболизма клеток; о глюконеогенезе как процессе поддержания уровня глюкозы крови. Сформировать знания о значении пентозофосфатного пути превращения глюкозы; синтезе и распаде гликогена, изучить метаболизм галактозы, фруктозы, этанола. Усвоить роль гормональной регуляции обмена углеводов в поддержании концентрации глюкозы в крови для умения интерпретировать характер биохимических нарушений у больных при патологии углеводного обмена.

В результате изучения темы студенты должны:

- иметь представление о роли углеводов в метаболизме человека; о проявлении

нарушений переваривания и всасывания углеводов для понимания патогенеза ряда

заболеваний ЖКТ.

- знатьстроениеглюкозы, фруктозы, рибозы, гликогена; основные этапы

и последовательность реакций аэробного и анаэробного катаболизма глюкозы, энергетический баланс аэробного и анаэробного катаболизма глюкозы; основные этапы глюконеогенеза и его физиологическую роль; строениегалактозы, фруктозы, схему их включения в метаболические процессы; этапы синтеза гликогена, особенности мобилизации гликогена в печени и мышцах; причины и клинические проявления гликогеновых болезней; окислительный этап пентозофосфатного пути окисления глюкозы и его биологическую роль; механизмы влияния адреналина, глюкагона и инсулина на метаболизм глюкозы.

- уметь объяснять особенности метаболизма глюкозы в разных тканях (органах); оценивать значение аэробного и анаэробного катаболизма глюкозы при разных физиологических состояниях организма; интерпретировать связь переключения процессов синтеза и распада глюкозы с ритмом питания и физической активностью; объяснять причины и последствия лактатацидоза; объяснять особенности метаболизма глюкозы в разных тканях (органах); оценивать значение синтеза и распада гликогена для поддержания гомеостаза глюкозы; объяснять молекулярные механизмы нарушений обмена гликогена; объяснять значение пентозофосфатного пути окисления глюкозы, причины и последствия нарушения этого процесса для органов и тканей.

- владетьглюкозооксидазным методом количественного определения глюкозы;

медико-функциональным понятийным аппаратом (терминами):гликолиз, глюконеогенез, лактатацидоз, гликогенозы, агликогенозы, галактоземия, фруктозурия, гипергликемия (гиперглюкоземия), гипогликемия (гиперглюкоземия), глюкозурия.

Этапы проведения занятия:

1. Вводная часть

2. Основная часть занятия: тест-контроль,