ЯМР-спектроскопия, ЭПР-спектроскопия.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) внастоящее времяявляется широко используемым методом для изучения структуры биополимеров, о взаимодействиях между молекулами и о молекулярном движении. Рассмотрим теоретические основы этого метода на примере ЯМР для ядер атомов водорода ¹Н.

Кроме заряда и массы, протон обладает механическим угловым моментом или спином I. Вращение заряженной частицы порождает магнитное поле; этот заряд можно представить как точечный магнит, ориентированный вдоль оси вращения. Напряженность этого магнитного поля выражается как магнитный момент µ_я. Подобно стержневому магниту, имеющему северный и южный полюс, µ_я имеет направление. Протоны схематически можно представить в виде микроскопических магнитных стрелок. При отсутствии внешнего магнитного поля протоны имеют хаотическое распределение. При наложении внешнего магнитного поля с напряженностью Н₀ возникает взаимодействие между магнитным моментом протона µ_я и Н_0. Энергия этого взаимодействия равна:

Е = g_я b_я Н₀

гдеg_я - ядерный g - фактор b_я – ядерный магнетон

Для протона ядерное спиновое квантовое число Iсоставляет +½ или – -½. Во внешнем магнитном поле Н₀ возможны две ориентации протонов: магнитные стрелки ориентируются по полю (параллельно линиям магнитного поля) с энергией E₁ = - 1/2g_я b_я H₀ ,

или против поля (антипараллельно линиям магнитного поля ) с энергией E₂ = + 1/2g_я b_я H₀ ,

Разность энергий между уровнями равна

DЕ = Е₂ - E₁ = g_я b_я H₀ ,

Между энергетическими уровнями ядер Е₂ и E₁ возможны переходы. При поглощении энергии электромагнитного излучения в области радиочастот ядрами происходит переход с одного уровня на другой. При наложении на систему ядер с различной ориентацией переменного магнитного поля (перпендикулярно постоянному магнитному полю Н₀) происходит поглощение энергии волны определенной частоты v₀.

v₀ = g_я b_я H₀/h , гдеh – постоянная Планка.

Поглощение энергии переменного магнитного поля ядрами атомов называют ядерным магнитным резонансом. Поглощенная энергия тратится на изменение ориентации ядер, т.е изменение спина ядра. Для измерения ЯМР используются ЯМР-спектрометры (Рис. 9). Этот прибор состоит из мощного электромагнита, который создает постоянное магнитное поле H_0. Между полюсами магнита которого поле H₁ с частотой до 10⁸ Гц , натравленное перпендикулярно H_0. Для достижения резонанса изменяют частоту переменного магнитного поля. При определенной частоте магнитные моменты ядер меняют ориентацию, происходит резонансное поглощение энергии переменного магнитного поля. Резкое изменение магнитного поля фиксируется детектором (катушка, в которой индуцируется электрический ток).

Любое ядро, например, протон, в магнитном поле может совершить только один переход. Спин протона может составлять или +1/2, или – 1/2 . Соответственно, спектр магнитного резонанса ядра должен состоять только из одной резонансной линии. Однако это не так, потому что ядра окружены электронами, и наложенное магнитное поле индуцирует также циркуляцию и этих электронов. Движущиеся электроны сами создают магнитное поле, которое также оказывает влияние на ориентацию ядра. Таким образом, наблюдаемая резонансная частота ядер определенных атомов зависит от их окружения, т.е. от структуры молекулы. Ценность ЯМР-спектроскопии обусловлена именно этим эффектом окружения, так как в молекуле резонансная частота определенного ядра одного и того же химического элемента будет зависеть от химической группы, к которой принадлежит ядро. Например, резонансная частота протонов метильной группы будет отличаться от частоты протонов аминогруппы. Более того, частота протонов метильной группы толуола будет отличаться от частоты метильной группы уксусной кислоты. Такое смещение резонансной частоты, обусловленное химическим окружением, называется химическим сдвигом.

Для измерения химических сдвигов в кювету с исследуемым веществом вводят эталонное вещество – стандарт. В качестве стандарта часто используют тетраметилсилан (СНз)₄Si. Это вещество имеет 12 эквивалентных протонов, которые дают одну резонансную линию. Этой резонансной линии приписывают произвольную величину Н₀ или v₀ и выражают химический сдвиг как смещение от этой величины. Величину смещения от эталона выражают в виде безразмерных единиц - миллионных доля (м. д .).

м. д. = (Н_обр - Н_эт ) 10⁶/ Н₀

где Н_обр и Н_эт –резонансная напряженность магнитного поля для образца и стандарта, соответственно.

Преимущество такой безразмерной шкалы состоит в том, что химические сдвиги не зависят от действительной величины Н₀ или от частоты переменного радиомагнитного поля и поэтому можно сравнивать спектры, полученные на разных ЯМР-спектрометрах. На рис. 9 представлен протонный спектр аминокислоты лизина, на котором видно несколько резонансных линий протонов, и влияние химической группы на ЯМР-сигнал.

Рис. 2. Блок-схема ЯМР-спектрометра:

1–образец; 2–магнит постоянного поля: 3–генератор переменного поля; 4 - генератор электромагнитного поля; 5 – катушка для передачи электромагнитного поля с частотой v; б–приемная катушка; 7–система регистрации сигнала ЯМР

ЯМР-томография. Вода в большом количестве входит в состав большинства биологических объектов. Основным ЯМР- сигналом биологических структур является сигнал протонного магнитного резонанса молекул воды. Интенсивность сигнала на данной частоте будет характеризовать относительное количество воды в ткани, которая находится в области определенного значения магнитного поля. Создавая в биологическом объекте градиент магнитного поля, можно получить спектр ЯМР протонов молекул воды. Профиль этого спектра будет определяться относительным содержанием молекул воды в той или иной части объекта. При помощи ЯМР-томографа биологический объект просвечивают во всех направлениях в магнитном поле. Затем с помощью компьютерного анализа воссоздают изображения по полученным проекциям.

Рис. 3. ЯМР-спектр лизина, растворенного в тяжелой воде. (Фрайфельдер, с.486)

А) структурная формула лизина

Б) Спектр ЯМР молекулы лизина.

1,2,3,4,5 – номера атомов углерода, у которых находятся протоны, дающие данную группу линий

t - химический сдвиг в м.д.

Таким образом, ЯМР-томография обеспечивает возможность изучения различных частей биологического объекта на основе различий амплитуды сигнала ЯМР в разных частях образца.

Таким методом определяются размер и положение областей в организме, различающихся по содержанию воды. Например, можно определить размер и положение внутренних органов, инородных тел, попавших в организм. Этот метод с успехом используются для определения размеров и локализации опухолей в организме человека. ЯМР-томография имеет большое преимущество перед рентгеновской томографией, так как радиочастотное электромагнитное облучение не вызывает повреждений биологического объекта.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)

Явление ЭПР состоит в резонансном поглощении энергии электромагнитного поля парамагнитным веществом, помещенным в постоянное магнитное поле. Однако не все электроны могут быть исследованы при помощи метода ЭПР. Большинство химических соединений состоит из атомов с заполненными электронными оболочками, в которых все электроны спарены вследствие антипараллельной связи между ними. В соответствии с принципом Паули в результате попарного взаимодействия электронов их собственные спиновые магнитные моменты взаимно скомпенсированы, а суммарный магнитный момент равен нулю.

ЭПР-поглощение определяется магнитными свойствами вещества, т. е. магнитными свойствами электронов и ядер атомов..

Электрон обладает и собственным механическим вращением – спином и связанным с ним магнитным моментом. Условием возникновения ЭПР является наличие у частиц исследуемого образца некомпенсированных магнитных моментов, обусловленных спином неспаренных электронов. В системах с нечетным числом неспаренных электронов каждый электронный уровень вырожден по спину, по крайней мере дважды, т. е. уровни, характеризующиеся положительным и отрицательным значением магнитного квантового числа электрона m.s (например +1/2 и – 1/2), не отличаются по энергии.

В отсутствие внешнего магнитного поля все электроны парамагнитного вещества имеют произвольную ориентацию спина и обладают одинаковыми энергиями, т. е. наблюдается вырождение энергетического уровня (рис. 41, а). При помещении образца, обладающего парамагнетизмом, в постоянное магнитное поле вырождение снимается, т. е. появляются энергетические уровни, связанные с разрешенными ориентациями элементарных магнитных моментов электронов (рис. 41, б). Промежуточные ориентации спинов относительно магнитного поля запрещены условиями квантования.

Рис. 4. Схема расщепления энергетических уровней неспаренных электронов при наложении внешнего магнитного поля при отсутствии сверхтонкого взаимодействия.

При наложении внешнего магнитного поля электронные уровни расщепляются на два подуровня в соответствии со значением спиновых чисел +½ и – ½ с разницей в энергии

DE=gbH,

где H – напряженность магнитного поля; b– магнетон Бора, равный 9,274 • 10^-24 Дж • Тл^-1.

На рис. 11 представлена схема расщепления энергетических уровней неспаренных электронов (спиновое квантовое число системы s = ½) при наложении внешнего магнитного поля. При этом энергия частиц, спины которых ориентированы по полю, на ½ gbH меньше энергии частиц в отсутствие внешнего магнитного поля. Энергия частиц, спины которых ориентированы против поля на 1/2 gbH, превышает значение в нулевом поле. Следовательно, разность энергий уровней равна gbH. Электроны в подсистемах Е₁ и Е₂ возникших во внешнем магнитном поле, почти равномерно распределяются по двум уровням энергии с незначительным преобладанием электронов со спином, ориентированным по полю.

Между двумя уровнями возможны энергетические переходы, в результате которых ориентация спинов будет изменяться на противоположную. Согласно принципам квантовой механики, переходы между энергетическими состояниями могут быть вызваны поглощением кванта hv. Если на спиновую систему, находящуюся в постоянном магнитном поле, воздействовать переменным сверхвысокочастотным электромагнитным полем с частотой v и энергией квантов hv, то при условии резонанса

hv = DЕ = gbH

индуцируются переходы между указанными энергетическими уровнями, т. е. происходит обращение спинов. При переходе с нижнего Е₁ уровня на верхний Е₂ происходит поглощение энергии электромагнитного поля; одновременно с такой же вероятностью осуществляются переходы с уровня Е₂ на уровень Е₁ с испусканием энергии. Как правило, поглощение превышает индуцированную эмиссию. Общее число неспаренных электронов в системе и разница в заселенности электронами двух энергетических уровней определяют интенсивность наблюдаемого сигнала ЭПР.

Измерение спектра ЭПР вследствие резонансных переходов электронов можно проводить двумя способами: 1) изменять напряженность магнитного поля Н при фиксированном значении частоты v; 2) изменять v при фиксированном значении Н. На практике ЭПР-спектрометры работают на фиксированной частоте v излучения при измененииН.

Как и ЯМР-спектрометр,ЭПР-спектрометрсостоит из электромагнита, источника СВЧ-излучения и электронной системы регистрации сигнала. Но поскольку ядерный магнетон более чем на три порядка меньше магнетона Бора, то при данной напряженности магнитного поля Н резонансная частота v для неспаренного электрона обычно в 10³ раз превышает частоту, на которой работают ЯМР-спектрометры. Если эксперименты по ЯМР проводятся на частотах в диапазоне мегагерц (10⁶ Гц), то ЭПР-спектрометры работают в диапазоне гигагерц (10⁹ Гц).

Основными параметрами сигнала ЭПР являются фактор спектроскопического расщепления (g-фактор), интенсивность (количество неспаренных электронов в образце), ширина и форма линии.

Фактор спектроскопического расщепления характеризует положение линии в спектре ЭПР, определяемое тем, насколько свойства неспаренных электронов, ответственные за поглощение энергии в данном веществе, близки к свойствам свободного электрона, магнетизм которого обусловлен только спином, а g-фактор равен 2,0023. Для большинства парамагнитных центров g-фактор отличается от значения 2,0023 в сторону, как уменьшения, так и увеличения.

Например, сигналы ЭПР, обусловленные низкоспиновым состоянием гемового железа цитохрома Р-450 имеют g₁ = 2,42, g₂ = 2,25 и g₃ =1,91. Восстановление этой молекулы переводит атом железа высокоспиновую форму со значениями g₁ = 6,1 и g₂ = 2,0 в спектре ЭПР.

Для парамагнитных центров, содержащих магнитные ядра, в спектре ЭПР возможно наблюдение сверхтонкой структуры (СТС), которая возникает в результате взаимодействия неспаренных электронов с магнитными моментами ядер. Аналогично электронным спинам, ядерные магнитные моменты, ориентируются в магнитном поле дискретно (либо вдоль внешнего магнитного поля, либо против него). Ядра многих атомов обладают спином и, следовательно, собственным магнитным моментом, который по абсолютной величине на три порядка меньше магнитного момента электрона. Количество компонентов сверхтонкой структуры определяется значениями ядерного спина данного атома по формуле 2I + 1, где I– значение ядерного спина атома. Следовательно, взаимодействие электрона с ядром приводит к расщеплению каждого электронного уровня энергии на 2I+ 1 уровней. Вследствие этого резонансное поглощение также расщепляется на 2I+ 1 равноудаленных линий одинаковой интенсивности.

С помощью метода ЭПР показано, что биологические системы животного и растительного происхождения содержат свободные радикалы, которые представляют собой молекулу или ее компоненты, имеющие неспаренный электрон. Свободные радикалы обладают парамагнитными свойствами благодаря и ее компенсированным магнитным моментам неспаренных электронов.

Метод ЭПР нашел эффективное применение для изучения молекулярных переносчиков электроннотранспортной цепи мембран митохондрий, включающих НАДН, флавины, кофермент Q₁₀, железосерные центры, цитохромы в, с₁,c, а также цитохром с-оксидазу. В митохондриях различных органов при низких температурах ( -200 С) регистрируется сигнал ЭПР с g-фактором 1,94, который обусловлен комплексами негемового железа в восстановленной форме.

ЭПР, ЯМР-спектроскопия получила дальнейшее свое развитие вследствие применения спиновых меток, синтезированных соединений, содержащих парамагнитный центр. При исследовании биологических молекул методом ЭПР в качестве спиновых меток широко используются нитроксильные радикалы (N^'–О), содержащие неспаренные электроны. Спиновые метки ковалентно связываются с какой либо атомной группой в исследуемой молекуле. Если парамагнитный радикал связывается с биологической молекулой электростатическими силами или гидрофобными взаимодействиями, то такой радикал называется спиновым зондом. В ЯМР-спектроскопии в качестве спиновых меток и зондов используются бромацетамид, N- (тетраметилпирролидинил)-мальимид.

Интерпретация интенсивности, ширины и формы линий спектра ЭПР спиновой метки, введенной в биологическую структуру, дает информацию о физических и физико-химических параметрах микроокружения введенного радикала.. Определение спектра ЯМР позволяет судить о фазовых переходах в липидном бислое мембраны и других средах. Так, параметр упорядоченности для липидов в жидком состоянии в несколько раз выше, чем в твердом состоянии. Снижение вязкости мембран приводит к уменьшению значения этого параметра.

Благодаря применению спиновых меток и зондов получены новые данные о строении и функционировании субклеточных структур, о липидах и белках, о липид-белковых взаимодействиях в мембранах.

Примеры использования ЯМР и ЭПР –спектроскопии:

1. Состояние молекул белков и липидов при фазовых переходах липидов мембран, белок-липидные взаимодействия

2. исследование свойств активных центров ферментов, роли кофактора в ферментно-субстратном связывании

3. Изменение структуры т-РНК при спаривании оснований

4. Измерение расстояния между атомными группировками, содержащие различные свободные радикалы