Абсорбционная спектроскопия

В основе абсорбционной (электронной) спектроскопии лежит физическое взаимодействие вещества с электромагнитным излучением. Длины волн, при которых происходит поглощение света, и степень поглощения зависят от структуры и от окружения молекулы вещества, поэтому абсорбционная спектроскопия является важным инструментом для характеристики различных низко- и высокомолекулярных соединений.

Когда волна сталкивается с молекулой вещества, она может либо рассеиваться (т.е. изменять направление распространения), либо поглощаться (т.е. передавать энергию молекуле). Относительная вероятность протекания того или иного процесса зависит от свойств той молекулы, с которой произошло столкновение. Если происходит поглощение электромагнитной энергии света, молекула переходит в возбужденное состояние. Молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света в видимой или ближней УФ-области, называется хромофором.

При обычной температуре электроны в молекулах находятся преимущественно в низких энергетических состояниях. Эти состояния называются основными, а все другие – возбужденными. На главные энергетические уровни накладываются колебательные уровни, которые указывают на различные типы колебаний молекулы (например, растягивание или изменение углов различных ковалентных связей). Изменение энергетического состояния при испускании или поглощении кванта называется переходом. На схеме энергетических уровней переходы изображаются вертикальными стрелками (рис. 1).

Для перехода на более высокий энергетический уровень электрону необходим некоторый запас энергии. Разность в энергии основного и возбужденного состояния соответствует поглощенной энергии излучения и определяется уравнением Эйнштейна – Бора.

hc

λ = ——— ,

E₂ – E₁

где λ - длина волны, h – постоянная Планка, с – скорость света, Е₁ – энергетический уровень молекулы до поглощения, Е₂ – энергетический уровень молекулы, достигаемый в результате поглощения.

Рис. 1

Типичная схема энергетических уровней, показывающая основное состояние (1) и первое возбужденное состояние (2). Тонкими горизонтальными линиями показаны колебательные уровни (3). Длинная стрелка указывает на возможный электронный переход между основным со­стоянием и четвертым колебательным уровнем первого возбужденного состояния. Корот­кая стрелка означает переход с одного колебательного уровня на другой в пределах основного состояния.

Следует сразу упомянуть, что не всякий энергетически возможный электронный переход ведет к поглощению: происходят только такие переходы, для которых существует определенная вероятность (окончательный момент перехода, который вытекает из определений квантовой механики). С другой стороны, соответствующий переход может быть запрещенным, например, колебание электронов может быть возбуждено лишь в том случае, когда основное и возбужденное состояние отличается симметрией распределения зарядов. Поглощение энергии происходит с наибольшей вероятностью только в том случае, если количество поглощенной энергии соот­ветствует разности энергетических уровней.

Зависимость интенсивности поглощения электромагнитного излучения от длины волны получила название спектра поглощения данного вещества. В спектре каждому уровню возбуждения электрона соответствует определенная линия поглощения. Если бы все переходы проходили только между самыми низкими колебательными уровнями основного и первого возбужденного состояния, тогда спектр поглощения состоял бы из узких, дискретных линий. Однако, поскольку возможны переходы с основного состояния на разные колебательные и вращательные уровни первого возбужденного состояния, а линии имеют конечную ширину, то спектр проявляется в виде относительно плавной кривой. Для большинства молекул длины волн, соответствующие переходам между основным состоянием и любым колебательным уровнем первого возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой области спектра. Более низкие по энергии переходы между колебательными уровнями в пределах одного электронного уровня происходят в результате поглощения излучения в инфракрасной области.

Интенсивность прошедшего света зависит от природы вещества, его концентрации и толщины слоя раствора и подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:

I = I₀×10 ^{– e l C}, то есть – e l C или e l C,

где С - концентрацией вещества, l - тол­щиной слоя раствора (длина оптического пути), I₀ и I – интенсивности падающего и прошедшего све­та. e - коэффициент пропорциональности, который зависит от природы вещества. Его удобно выражать в М^–1см^–1. В этом случае e носит название молярного коэффициента поглощения (экстинкции) и соответствует поглощению раствора с концентрацией в 1 М при длине оптического пути в 1 см.

Результаты измерения чаще всего выражают как оптическую плотность

I₀

D = lg ――

I

Величиной D удобно пользоваться, поскольку она связана прямопропорциональной зависимостью с концентрацией вещества в соответствии с уравнением

D = e l C

В некоторых случаях, если С велико, e становится функцией С, и тогда можно сказать, что закон Бера наруша­ется. Это может быть результатом рассеяния света или структур­ных изменений вещества (например, димеризации, агрегации или химиче­ских изменений) при высоких концентрациях.

Контрольные вопросы

1. Теория поглощения света молекулами.

2. Возбужденное состояние молекулы.

3. Энергетические уровни.

4. Спектр поглощения.

5. Закон Бугера-Ламберта-Бера.

6. Молярный коэффициент поглощения.

Литература

21. Квасюк Е.И., Бокуть С.Б., Методы структурной биологии в изучении функции белков. Практикум, Мн.: МГЭУ, 2009, 83 С., 5,25 печ. л.

22. Киселев П.А., Бокуть С.Б., Курс лекций по физической химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 141 С.

23. Киселев П.А., Бокуть С.Б. Курс лекций по коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 54 С.

24. Бокуть С.Б., Подобед Л.Ф., Киселев П.А., Сборник задач по физической и коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ, 2007, 99 С.,

25. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. М.: Высшая школа, 2003.

26. Физическая химия. Под ред. Краснова К.С. М.: Высшая школа, 1982.

Ход работы

Задание

Определить концентрацию метгемоглобина по абсолютному спектру поглощения и по калибровочному графику

1. Приготовить раствор гемоглобина с концентрацией 5∙10^-5М, используя навеску гемоглобина (32,3 мг) и 0,05 М натрий-фосфатный буфер, М_{гемоглобин} = 64500;
2. Рассчитать объемы гемоглобина и натрий-фосфатного буфера для приготовления 2 мл растворов гемоглобина с концентрациями 0,5; 1; 2; 3 и 4 ∙ 10^-5 М из исходного раствора гемоглобина (5∙10^-5М).
3. Приготовить по 2 мл раствора гемоглобина с концентрациями 0,5; 1; 2; 3 и 4 ∙ 10^-5 М, растворяя исходный раствор гемоглобина (5∙10^-5М) 0,05 М раствором натрий-фосфатного буфера.
4. Измерить оптическую плотность полученных растворов и исходного раствора на спектрофотометре при длине волны λ = 540 нм. В качестве нулевого раствора использовать раствор натрий-фосфатного буфера.
5. Измерить оптическую плотность раствора гемоглобина с неизвестной концентрацией.
6. Рассчитать точную концентрацию гемоглобина, используя молярный коэффициент поглощения ε, равный 13,8 мМ^-1см^-1 для максимума поглощения в длинноволновой области спектра на 540 нм по формуле:

C = D/ ε l,

где C – концентрация гемоглобина, D – величина оптической плотности, ε– молярный коэффициент поглощения и l – толщина кюветы.

1. Построить калибровочную зависимость величины оптической плотности (D) от концентрации гемоглобина (С).

8. Определить по калибровочному графику неизвестную концентрацию гемоглобина.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Начертить калибровочный график.

4. Оформить результаты измерений.

5. Сделать выводы.

Лабораторная работа № 6

Тема:   Цель работы:

Влияние додецилсульфата натрия в различных концентрациях на процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин Методом разностной спектрофотометрии определить влияние различных концентраций додецилсульфата натрия на процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин. Определить величину кажущейся константы диссоциации, KS, отражающей взаимодействие додецилсульфата натрия с молекулами гемоглобина

Оборудование и материалы:

· Спектрофотометр «Solar»;

· Кюветы кварцевые;

· Пробирки стеклянные;

· Штативы для пробирок;

· Стакан стеклянный;

· Пипетки стеклянные.

Реактивы:

· Раствор 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7,4;

· Навеска гемоглобина (30 мг);

• Раствор додецилсульфата натрия (SDS), CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na (10^-4 М).

Теоретическая часть