Химические свойства и использование их в лабораторной практике

Лекция № 1.

ТЕМА «ВВЕДЕНИЕ».

1. Предмет и задачи биохимии.
2. История развития биохимии.
3. Объекты биохимических исследований. Понятие о методах их получения (наблюдение за целостным организмом, выделение и хранение отдельных органов, метод тонких срезов, метод клеточных культур).
4. Сущность биохимического эксперимента.
5. Понятие о методах, применяемых в биохимических исследованиях (экстракция, фракционирование, центрифугирование, хроматография, электрофорез, радиологический метод) и способы оценки полученных результатов.
6. Роль биохимических методов в общем комплексе обследования пациента.
7. Место биохимии в подготовке современного специалиста по лабораторной диагностике.

Биологическая химия – наука, которая изучает химический состав и химические процессы, лежащие в основе жизнедеятельности организма. Биохимия изучает молекулярные основы жизни. Основные достижения науки начинаются с 50-х годов ХХ века и продолжаются до настоящего времени. Эти достижения заключаются в следующем:

Ø выяснены химические основы ряда важнейших биологических процессов;

Ø установлены функции важных биологических молекул;

Ø определены общие пути превращения молекул и общие принципы, лежащие в основе разнообразных проявлений жизни;

Ø выяснены многие аспекты регуляции метаболизма;

Ø выделены главные органеллы живых клеток и установлены их функции;

Ø получен в чистом виде ряд ферментов и изучен механизм их действия;

Ø накоплено значительное количество данных о механизме действия гормонов;

Ø установлены механизмы образования и использования энергии в клетке;

Ø выяснены особенности строения и функции мембран;

Ø установлены биохимические основы значительного числа болезней;

Ø расшифрованы многие механизмы функционирования клеточного генома, нашедшие применение в практическом здравоохранении.

Биохимия связана с физикой, химией, механикой, математикой, кибернетикой и другими науками, которые снабжают биохимию необходимыми высокоочищенными реактивами и препаратами, рекомендуя новые физико-химические методы исследования, необходимые приборы для их выполнения. Развитие физиологии и гигиены основано на достижениях биохимии. С учетом биохимических данных решаются проблемы сельского хозяйства: повышение урожайности с/х культур, увеличение производства продуктов животноводства, вопросы использования удобрений и средств защиты растений от вредителей. Знания биохимии необходимы для развития пищевой, кожевенной, текстильной промышленности. Основными задачами являются:

1. изучение химического состава живых организмов;

2. изучение химических процессов, процессов обмена веществ, лежащих в основе жизнедеятельности организма;

3. изучение структуры питательных веществ, их переваривания и всасывание в организме.

Полное понимание на молекулярном уровне всех химических процессов связанных с жизнедеятельностью клетки можно решить, если выделить из клетки соединение, определить его структуру и установить функцию.

В истории биохимии можно выделить 4 периода. С древних времен и до эпохи Возрождения (ХV в) длился I период истории биохимии. В то время человек использовал биохимические процессы (изготовление сыра, пива, вина, табака, хлеба и т.д.).

Во II периоде (до середины ХIХ века) шло накопление знаний по химии живой материи. Немецкий врач Парацельс более 400 лет назад высказал точку зрения, актуальную и сегодня. Он полагал, что в основе жизнедеятельности организма лежат химические процессы и для лечения болезней необходимо использовать химические средства. В 1814 году в России К. Кирхгоф описал ферментативный процесс расщепления крахмала, а в 1828 году немецкий химик Вёлер получил химическим путем мочевину – вещество, которое содержится в крови и моче человека и животных.

III период завершается в 40-50-х годах ХХ века. Биохимия сформировалась как наука. В 60-е годы XIX создаются кафедры медицинской, а затем биологической химии. В 1869 году врач Мишер открывает нуклеиновые кислоты, в 1880 году Лунин Н.И. получает первые данные о витаминах. Благодаря исследованиям А.Я. Данилевского, М.М. Монассеиной, И.П. Павлова в России, братьев Бюхнеров и Либиха в Германии получает новое направление учение о ферментах. В 1902 году Фишер в Германии впервые искусственно синтезировал пептиды и разработал пептидную теорию строения белков. К середине ХХ века установлены основные пути превращения белков, углеводов и липидов в живой клетке, появилось новое направление в биохимии – биоэнергетика. В 1937 году Браунштейн и Крицман в России открыли ферментативный процесс переаминирования аминокислот, в 1939-1942 годах Н.А. Энгельгардт и М.Н. Любимова изучили АТФ-азную активность актина и миозина – главных сократительных белков мышц.

IV период – период важнейших открытий в биологии. Использование физико-химических и математических методов позволило выявить молекулярные основы хранения и передачи генетической информации, механизмов биосинтеза белка, изучить структуру и функцию мембран, гормонов и др. Величайшее открытие американскими учеными Уотсоном и Криком пространственной структуры ДНК позволило понять функцию этой молекулы, а на основе этого возникла новая наука – молекулярная биология. В 1967 году синтезируется ДНК вируса, в 1970 г – искусственный ген, в 1966 г – химиоосмотическая теория окислительного фосфорилирования и др.

В настоящее время биохимические исследования широко проводятся в лабораториях развитых стран мира. Остается еще много проблем, которые предстоит решить биохимии в ближайшее время. (Мало известны механизмы развития и дифференцировки клеток; примитивны знания в области механизмов деления клеток; практически неизвестны химические основы психической деятельности человека, механизмы секреции и т.д.)

Биохимики пользуются большим арсеналом методов исследования. Элементарной ячейкой жизни является клетка. Она главный объект исследований и материал для исследования. К изучению клетки как материала для исследования биохимия пришла не сразу. В начале объектом исследования служили интактные животные. Такой метод позволил открыть ряд важнейших соединений – витаминов, аминокислот, липидов – незаменимых в питании организмов соединений. Удаление отдельных органов и наблюдения за изменениями в целом организме позволили выяснить роль этих органов. После разработки методов и искусственного хранения удалось изучить особенности отдельных процессов, специфичных для этих органов. Этому способствовало внедрение методов, использующих тонкие срезы органов и культивирование клеток (метод клеточных культур).

Одновременно с экспериментами на животных проводились обширные исследования с использованием микроорганизмов. Чтобы проследить за превращениями какого-либо соединения в организме в классической постановке эксперимента, исследователь вынужден был вводить большое количество исследуемого вещества из-за недостаточно высокой чувствительности методов выделения промежуточных продуктов его обмена. Количество вводимого вещества обычно намного превышало физиологическую норму, что оказывало влияние на результаты и выводы были недостаточно точны. Эту проблему удалось решить, используя изотопный метод.

Изотопный метод – позволяет изучить обмен отдельных веществ. Различают 2 вида изотопов: стабильные изотопы, которые входят в состав природных соединений в небольшом количестве, и радиоактивные изотопы, получаемые искусственно, на ядерных реакторах. Радиоактивные изотопы используются в радиоавтографии, которая позволяет указать место локализации изотопа в клетке, на хроматограмме и т.д. Для этой цели после введения изотопа и проведения исследования полученный материал накладывают на пленку, покрытую чувствительной фотоэмульсией. Испускаемые при распаде частицы вызывают на пленке почернение, позволяющее обнаружить соединения, меченые изотопом. Например, использование ¹⁵N позволило обнаружить высокую скорость обновления белков в тканях, ³²Р, ³⁵S – помогло изучить процессы обмена фосфора и серы.

В арсенале методов исследования биохимика особое место занимают физико-химические методы (электронная микроскопия; дифференциальное центрифугирование, позволяющее разделить клетку на её составляющие компоненты; разделение веществ на основе их различной в растворимости в растворителях, адсорбции и т.д.).

Наиболее простой метод – экстракция (вытяжка), ее проводят при низкой температуре, физиологических значениях рН и концентрации солей. Для экстракции липидов обычно используют органические растворители.

Экстракты из отдельных тканей выделяют после предварительного разрушения клеток – гомогенизации, которую ведут вручную или при помощи вращающихся в стеклянных сосудах пестиков. Эту процедуру проводят при низкой температуре (0 – 4ºС). После такой обработки измельченная ткань превращается в гомогенат, который далее подвергают центрифугированию. Классический вариант предполагает 3 этапа центрифугирования со все более высокой скоростью. На каждом этапе соответственно получают ядерную, митохондриальную и микросомальную фракции. Для получения более чистых фракций, помимо обычного центрифугирования, используют и центрифугирование в градиенте плотности каких-либо соединений. Центрифуги – специальные технические устройства, позволяющие вращать пробирки с большой скоростью. Путем простого центрифугирования получают две фракции: осадок на дне пробирки из более плотных частиц и вторая – жидкая, называемая супернатантом. При центрифугировании в градиенте плотности вначале пробирку заполняют, например, раствором сахарозы (зональное центрифугирование), концентрация которого линейно увеличивается от 5% у верхнего края пробирки до 20% у её нижнего края. При центрифугировании частицы оседают с разной скоростью, образуя отдельные полосы вдоль длины пробирки. В пробирке обычно прокалывают дно и собирают вытекающую жидкость при помощи коллектора по каплям.

При равновесном центрифугировании используют раствор хлорида цезия, образующий при длительном центрифугировании градиент плотности, на который наносят смесь частиц для разделения. Частицы собирают в поперечные зоны по их плотностям. Полученные фракции можно сразу или после предварительной очистки использовать для дальнейших исследований, которые могут включать анализ структуры или изучение обмена и функций биомолекул.

Анализу структуры должны предшествовать методы выделения и очистки фракций от примесей. Для разделения молекул используют хроматографию и электрофорез:

1. Хроматография – используется для разделения молекул, помещенных в подвижную фазу (жидкость, газ) и перемещаемых вдоль неподвижной фазы (твердые вещества или жидкость). При этом происходит разделение на основе разной адсорбции веществ на неподвижной фазе, разных зарядов разделяемых молекул, разных размеров или разной растворимости в неподвижной фазе. Существует большое число методов хроматографии:

- на бумаге

- ионообменная

- тонкослойная

- газожидкостная

- гельфильтрация и др.

2. Фракционирование с различными концентрациями солей (высаливание белков и др.).

3. Электрофорез – метод основан на том, что в электрическом поле молекулы веществ, обладающие зарядом, передвигаются с различной скоростью. Так разделяют на фракции белки крови. Разновидности электрофореза:

- высоковольтный на бумаге

- на агарозе

- на ацетате целлюлозы

- на полиакриламидном геле.

Ультрацентрифугирование.

Выше указанными методами выделяют биомолекулы, разрушают их на мономеры, которые разделяют электрофорезом или хроматографией.

В биохимических исследованиях применяют также и спектральные методы – разделение веществ, дающие различные спектры поглощения лучей света (например гемоглобины); пламенную фотометрию, которая основана на способности ряда простых веществ (металлов: макро- и микроэлементов) испускать свет при помещении анализируемого образца в источник высокой температуры; люминисценцию и флюориметрию, которые основаны на способности многих органических веществ (фенолов, ароматических аминов и др.) давать характерный спектр испускания при освещении исследуемого образца ультрафиолетовым или другим коротковолновым излучением; цветные реакции – в основе лежит образование окрашенного продукта. Например,α-аминокислоты открываются нингидриновой реакцией, при которой развивается сине-фиолетовое окрашивание, при реакции Троммера глюкоза выпадает в осадок кирпично-красного цвета и др.

В научных целях, позволяющих изучать структуру веществ используются:

- рентгеноструктурный анализ

- электронная микроскопия

- электронный парамагнитный рисунок и др.

Как всякая наука, биохимия располагает специфическими методами научного исследования. Общая их черта состоит в том, что при изучении обмена веществ исследуемое химическое соединение или набор определенных соединений вводят в системы, обладающие свойствами живого, и изучают их превращения. Для этого биохимия располагает и использует разнообразные методы анализа и различные физико-химические методы, перечисленные выше. Вместе с тем внедряются иммунохимические, радиоиммунологические методы, метод ДНК-ДНК-, метод ДНК-белок и др.

Результаты биохимических исследований являются лишь частью биохимических параметров об обследуемом человеке. Однако тесная связь биохимических параметров с наиболее существенными процессами метаболизма позволяет в ряде случаев выявлять биохимическими методами ранние и скрытые формы патологии, что может существенно расширить возможности ранней диагностики сахарного диабета, нарушений липидного обмена, подагры, наследственной патологии у новорожденных. Таким образом биохимия позволяет:

1) выявить причину болезни;

2) предложить методику обследования для ранней диагностики (фенилкетонурия);

3) предложить метод лечения;

4) следить за ходом болезни;

5) контролировать эффективность лечения;

6) изучить фармакодинамику и фармакокинетику лекарств с помощью биохимического мониторинга организма и биологических методов определения действующих начал и метаболитов лекарств во времени.

В подготовке современного специалиста по лабораторной диагностике биохимия занимает важное место. Окружающая среда обеспечивает человека необходимыми питательными веществами, входящими в состав пищевых продуктов. Изучение структуры питательных веществ, их переваривание и всасывание в организме – вопросы, которыми занимается биохимия. Чтобы быть грамотному специалисту, необходимо глубоко изучить химию органических веществ, биохимические методы исследования как способа оценки состояния целостного организма, а так же органов и тканей. Учащиеся во всех темах изучают вопросы профилактики нарушений работы органов, систем, биохимических процессов, значение здорового образа жизни для поддержания функциональной стабильности организма; биохимия изучает пагубное влияние наркотиков, алкоголя, курения на протекание биохимических процессов, их влияния на результаты лабораторных исследований.

Будущий специалист должен уметь самостоятельно работать с учебной и справочной литературой, инструкциями, нормативными документами, освоить клинико-биохимические методы исследования и в этом важная роль биохимии.

Лекция № 2.

ТЕМА «ХИМИЯ УГЛЕВОДОВ».

1. Классификация углеводов, их биологическое и клиническое значение.
2. Моносахариды: классификация по строению молекулы (альдозы, кетозы, пентозы, гексозы).
3. Линейная и циклическая формулы глюкозы, фруктозы, галактозы, рибозы.
4. Химические свойства моносахаридов и использование их в лабораторной практике.
5. Методы определения моносахаридов.
6. Соединения моносахаридов, их биологическое значение:

а) гексуроновые кислоты,

б) аминосоединения,

в) фосфорные эфиры.

Углеводы – полиоксикарбонильные соединения и их производные – являются органическими соединениями, которые входят в состав клеток тканей всех живых организмов. Считают, что в биосфере больше углеводов, чем всех других органических соединений, вместе взятых. Это объясняется повсеместным распространением в больших количествах двух полимеров глюкозы – целлюлозы и крахмала.

В организме человека и животных содержание углеводов около 2% от сухой массы тела. Содержится гликоген в мышцах, печени. Углеводсодержащие белки (гликопротеины и мукопротеины) – составная часть слизей организма, транспортных белков плазмы и иммунологически активных соединений (группоспецифические вещества крови).

Суточная потребность до 600 г, колеблется с учетом возраста, пола, рода трудовой деятельности и других факторов.

Биологические функции углеводов разнообразны и важны.

1. Источник энергии, покрывают 60% потребности организма. При окислении 1 г углеводов освобождается 16,9 кДж энергии.
2. Запасной питательный материал – гликоген (в печени, в мышцах).
3. В комплексе с белками входит в состав хрящевых тканей (хондроитинсульфаты) и др. соединительнотканных образований. Как было сказано выше, входят в состав слизей организма, таким образом выполняют защитную и опорную функции в организме.
4. В состав многих тканей и органов входят комплексы углеводов с липидами – гликолипиды. Особенно богат этими соединениями головной мозг. Гликолипидов также много в селезенке, форменных элементах крови, костном мозге.
5. Пластическую функцию – углеводы используются на синтез нуклеиновых и жирных кислот, а из них – аминокислот, белков, липидов и т.д.
6. Регуляторную функцию – так клетчатка, вызывая механическое раздражение кишечника, способствует его перистальтике и улучшает пищеварение; моносахариды играют существенную роль в регуляции осмотических процессов.
7. Специфические функции:

- роль антикоагулянтов

- основа некоторых слизей

- входят в группоспецифичные вещ-ва крови и др

1. Углеводы необходимы для нормального окисления жиров и белков.

Углеводы широко используют в практике здравоохранения. Раствор глюкозы вводят в организм для улучшения сердечной деятельности, поддержания тонуса нервной системы. Глюконат кальция дают больным как успокаивающее средство. Высокомолекулярные углеводы, например, полиглюкин используют как кровезаменитель при кровопотерях, шоковом состоянии. Группа лекарственных веществ, в частности, сердечные средства (дигиталис и др.) представляют собой большое количество производных углеводов, так называемые гликозиды.

В клинических лабораториях для диагностики нарушений функции поджелудочной железы определяют содержание глюкозы в крови и моче. Врожденные нарушения обмена гликозаминогликанов вызывают тяжелые осложнения, чаще всего несовместимые с жизнью. Определение активности ферментов, участвующих в их обмене, и продуктов обмена гликозаминогликанов используется для диагностики заболеваний соединительной ткани.

Общая формула С_n(Н₂О)_m. Однако среди углеводов встречаются вещества, не соответствующие этой формуле. Термин «углеводы» достаточно условный и не всегда соответствует химической структуре этих веществ, но он прочно вошёл в жизнь и им продолжают пользоваться.

Моносахариды – многоатомные алифатические спирты, которые содержат в своем составе альдегидную группу или кетогруппу. Тип моносахарида зависит от длины углеводородной цепи и от содержания альдегидной или кетоновой группы. В зависимости от строения молекулы моносахаридов разделяют на:

О

- альдозы (альдегидоспирты), например, глюкоза – СН₂ОН-(СНОН)₄-С

Н

- кетозы (кетоноспирты), например, фруктоза – СН₂ОН-(СНОН)₃- С-СН₂ОН

О

О

- пентозы (пятиатомные спирты)–СН₂ОН-(СНОН)₃-С (С₅Н₁₀О₅)

Н

О

- гексозы (шестиатомные спирты) – СН₂-ОН-(СНОН)₄-С

Н

Установлено, что в растворе глюкозы находится не только ее альдегидная форма, но и молекулы циклического строения.

Циклическая формула показывает не только порядок связи атомов, но и их пространственное расположение. Одни атомы или группы атомов находятся над плоскостью кольца, другие – под плоскостью, т.е. возможны 2 циклические формы:

СН₂ОН

Н О Н

Н

ОН Н α – форма глюкозы

ОН

НО

Н ОН

ОН

СН₂ОН

Н О

Н

ОН Н β – форма глюкозы

ОН

НО Н

Н ОН

Циклические формы находятся в равновесии, превращение α-формы в β-форму и обратно происходит через промежуточное образование альдегидной формы:

написать формулы.

Таким образом, в водном растворе глюкозы находятся в динамическом равновесии 3 изомерные формы: α, β и альдегидная.

В циклических формах альдегидная группа отсутствует. Циклической формой углеводов объясняются их многие химические свойства.

Фруктоза имеет линейную форму, а также форму пятичленного цикла (этот сахар называется фруктофураноза).

написать формулы

Химические свойства и использование их в лабораторной практике.

1. Окисление как для оксиальдегидов, так и для оксикетонов. Все моносахариды сильные восстановители. В нейтральной среде:

написать формулы.

В щелочной среде:

О

R – С + Сu²⁺ → Сu₂О + продукты окисления

Н реактив

альдоза Фелинга

или R-СН=О + Аg(NН₃)₂⁺ → Аg + продукты окисления

альдоза реактив

Толленса

Окисление глюкозы используется для определения ее содержания в различных биологических средах. Например, в моче глюкозу определяют с помощью раствора гидроксида меди, который, окисляя глюкозу, восстанавливается до оксида меди (I) кирпично-красного цвета. На этом принципе основан метод определения глюкозы в крови с помощью раствора красной кровяной соли К₃[Fе(СN)₆]. При наличии глюкозы (в щелочной среде) эта соль восстанавливается и образует желтую кровяную соль – К₄[Fе(СN)₆]. Для обнаружения моносахаридов используется реакция «серебряного» зеркала с реактивом Толленса.

1. Восстановление карбонильной группы моносахаридов в спиртовую приводит к многоатомным спиртам, называемым альдитами (сахарные спирты).

О

С-Н СН₂ОН

Н-С-ОН Н-С-ОН

[Н]

НО-С-Н НО-С-Н

Н-С-ОН Н-С-ОН

СН₂ОН Д-ксилит СН₂ОН Ксилит

О

С-Н СН₂ОН

Н-С-ОН Н-С-ОН

[Н]

НО-С-Н НО-С-Н

Н-С-ОН Н-С-ОН

Н-С-ОН Н-С-ОН

СН₂ОН СН₂ОН

Д-глюкоза Д-глюцит (сорбит)

Ксилит, сорбит - заменители сахара при сахарном диабете.

Сорбит – как промежуточное вещество для получения Vit «С».

1. Реакции спиртовых гидроксильных групп. Моносахариды образуют простые и сложные эфиры.

ОН

написать формулы.