Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа (1.3.99.1.) катализирует окисление сукцината до фумарата. Кофактором фермента является ФАД - флавинадениндинуклеотид.

Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, характеризуется абсолютной стереоспецифичностью элиминирования водорода, так что отщепляются исключительно атомы водорода в транс - положении. Если бы подобная специфичность не существовала, образовалась бы смесь (50:50) двух изомерных ненасыщенных дикарбоновых кислот; малеиновой (цис) и фумаровой (транс). Однако образуется только фумаровая кислота:

FАD FАDН₂

Н Н		НООС Н Н Н
½ ½	сукцинат-	\ / ½ ½
НООС ¾С¾С¾СООН	¾¾¾¾>	С= С + С = С
½ ½	<¾¾¾¾	/ \ ½ ½
Н Н	дегидроге наза	Н СООН НООС СООН
				фумаровая к-та малеинова к-та
				(транс) (цис)
				образуется не образуется

é Цис и транс изомеры получились бы совместно,ù

ë если реакцияидет неспецифична û

Среди ферментов цикла лимоннонной кислоты сукцинатдегидрогеназа занимает особое место, поскольку локализована в митохондриальной мембране:

		О					ОН
		||					|
		С					С
	/	\				//	\
	СI¾С	С¾СI				СI¾С	С¾СI
	||	||				|	||
	Н¾ С	С¾Н				Н¾ С	С¾Н
	\	/				\\	/
СООН		С			СООН		С
½		||	сукцинатдегидро-	½		|
СН2	+	N	¾¾¾¾¾¾¾>	СН	+	N¾ Н
½		½	геназа (скелетной	||		½
СН2		С	мышцы)	СН		С
½	//	\			½	//	\
СООН	Н¾ С	С¾ Н			СООН	Н¾ С	С¾ Н
	|	||				|	||
	Н¾ С	С¾Н				Н¾ С	С¾Н
	\\	/				\\	/
		С					С
		|					|
янтарная	ОNа			фумаровая	ОNа
кислота				кислота

окисленная форма восстановленная форма

(синий цвет) (бесцветная)

Принцип метода. В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6 - дихлорфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6 - дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения - бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц обнаруживают, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабевается, благодаря бесцветной форме 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Ход работы. В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку(опытную) добавляют 5 капель 5 %- ного раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н. раствора едкого натра, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 н. раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной мышечной ткани (свежей). Обе пробирки помещают на 20 мин. в термостат при 37 ⁰С. Сравнивают интенсивность окрашивания в контрольной и опытной пробирках. Делают выводы и оформляют таблицу 2.

Таблица 2 - Основные параметры опыта и его результаты

№ опыта	Субстрат	Фермент	Тип катализируемой реакции	Условия проведения опыта (toС, рН, добавление др. реагентов)	Наблюдения

Материалы и реактивы: экстракт мышечной ткани (см. Приложение В, п.3); фосфатный буфер, рН 7,4 (см. Приложение В, п.4); 5 % - ный раствор янтарной кислоты; 0,1 н. раствор NаОН; 0,001 н. раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Оборудование: пробирки; пипетки; термостат.

Глюкозооксидаза (1.1.3.4)

Это двухкомпонентный фермент, содержащий в качестве простетической группы две молекулы флавинаденидинуклеотида (ФАД). Этот фермент катализирует дегидрирование глюкозы и перенос отнятого водорода на кислород воздуха с образованием пероксида водорода. При этом глюкоза превращается в глюконолактон:

СН2ОН				СН2ОН
Н ½ О ОН				Н ½ О
Н		+ О2		Н С = О
ОН Н	¾¾¾¾¾¾>	ОН Н +	Н2О2
НО Н				НО
Н ОН				Н ОН
b - D- глюкопираноза b - глюконолактон

В живых клетках и неочищенных ферментных препаратах, используемых в промышленности, глюкозооксидаза всегда присутствует с глюконолактоназой и каталазой, глюконолактон превращается в глюконовую кислоту:

СН2ОН		СН2ОН
Н ½ О		Н ½ ОН
Н С = О	глюконолактоназа	Н СООН
ОН Н +Н2О		ОН Н
НО		НО
Н ОН		Н ОН
глюконолактон D - глюконовая кислота

Пероксид водорода разлагается каталазой:

каталаза

2 Н₂О₂ ¾¾¾¾¾¾¾¾> 2 Н₂О + О₂

Так как очищенные препараты глюкозооксидазы взаимодействуют практически лишь с глюкозой, она является одним из важнейших ферментов, применяемых в пищевой технологии и клинической биохимии для определения сахара.

Глюкозооксидаза используется в пищевой промышленности как для удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода, при производстве сухого яичного порошка, пива, вина, соков, майонеза. Для удаления кислорода из продуктов, содержащих жир, упаковочный материал - синтетическую пленку - пропитывают глюкозооксидазой, глюкозой и буфером.