Особенности выделения пероксидазы из биологического материала и определения ее активности.
Среди множества окислительно-восстановительных ферментов пероксидаза привлекает особое внимание исследователей из-за своей полифункциональности и широкой распространенности в различных живых организмах. Пероксидаза – это двухсубстратный фермент, катализирующий реакции окисления субстратов за счет кислорода перекиси водорода:
АН + Н2О2 → АОН + Н2О
Фермент обладает широкой субстратной специфичностью. К субстратам, окисляемым пероксидазой в присутствии перекиси водорода, относятся большинство фенолов (производные пирокатехинов, пирогаллолов, гидрохинонов, а также резорцин, гваякол др.), производные бензидина, анилина, п-толуидина, а также адреналин, ароматические кислоты (производные бензойной, салициловой, галловой кислот), аскорбиновая кислота, нитриты, тиолы и ряд других соединений.
Согласно Международной классификации ферментов пероксидаза – это фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора электронов. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза – донор:Н2О2-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7).
Пероксидаза является гемсодержащим гликопротеином. Считают, что пероксидаза имеет один активный центр, в состав которого входит трехвалентный атом железа гема, не меняющий своей валентности. Однако полифункциональность пероксидазы не исключает возможности наличия и второго каталитического участка на поверхности нативной молекулы белка. Гем, выполняя роль активного центра, участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего образуются промежуточные радикалы соответствующих субстратов. Углеводные цепи предохраняют фермент от инактивации радикалами, образующимися в ходе реакций, и увеличивают термическую стабильность пероксидазы.
Пероксидаза характеризуется наличием большого числа изоферментов, что говорит о важной физиологической роли этого фермента в клетках различных организмов. В настоящее время установлено, что активность изоформ пероксидазы сильно зависит от присутствия определенных субстратов, поэтому физиологические функции отдельных изоформ фермента значительно различаются и определяются их субстратной специфичностью.
Для пероксидаз установлены видовые, органогенные и внутриклеточные особенности структуры и локализации изоферментов. Например, присутствие фермента в хлоропластах указывает на его участие в окислительно-восстановительных реакциях в процессе фотосинтеза, а обнаружение пероксидазы в митохондриях – на ее участие в энергетическом обмене клетки. Вместе с тем у растений отмечается наличие как ферментов, общих для всех тканей, так и изоферментов, специфичных только для отдельных органов или образующихся лишь в определенные периоды развития растения. Изоферменты необходимы для биосинтеза лигнинов, меланинов и других вторичных метаболитов, необходимых для нормального роста и функционирования растений.
Для экстракции пероксидазы из растительных тканей можно использовать трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,0), содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), фенилметиленсульфонилфторид (PMSF) и дитиотреитол.
ЭДТА вводится в буферный раствор для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут содержаться в применяемых реагентах и приводить к ингибированию активности фермента.
Фенилметиленсульфонилфторид является ингибитором протеаз. Он необходим для защиты белков экстракта от действия клеточных протеаз, которые высвобождаются в процессе разрушения клеточных структур.
Дитиотреитол необходим для предотвращения окисления SH-групп белков. С этой же целью возможно применение b-меркаптоэтанола или глутатиона.
Активность изоформ пероксидазы зависит от концентрации белка и субстратов в зоне реакции, а также величины рН. В связи с этим необходим подбор оптимальных условий проведения ферментативной реакции по каждому из этих параметров. Это позволит установить зависимости пероксидазной активности при ферментативном окислении каждого из субстратов в присутствии Н2О2 от концентрации белка и субстратов, а также величины рН и определить максимальную активность фермента. В качестве субстратов пероксидазного окисления используют о-дианизидин, гваякол и конифериловый спирт. Два последних необходимы для биосинтеза лигнинов, а о-дианизидин является универсальным субстратом, который окисляется всеми изоформами пероксидаз.
При выборе оптимальной концентрации перекиси водорода изучают зависимость активности фермента от концентрации Н2О2 (1 · 10-5 −1 · 10-3 М) при постоянной концентрации второго субстрата ~1 · 10-4 М (это обусловлено диапазоном экстинкций спектрофотометра), концентрации белка ~10-7-10-8 М активных центров и нейтральном значении рН. Затем измеряют активность фермента в зависимости от концентрации второго субстрата (1 · 10-5−1 · 10-3 М) при оптимальной концентрации Н2О2, сохраняя прежними остальные параметры. Определив оптимальную концентрацию второго субстрата, проводят измерение активности фермента в зависимости от концентрации белка (0,5−2,0 мг/мл) при оптимальных значениях концентрации обоих субстратов и нейтральном значении рН. После этого аналогичным образом определяют оптимальную величину рН (значения рН изменяются в пределах от 5,0 до 9,0 с шагом 0,5).
Оптимальными значениями концентрации каждого из субстратов и величины рН считаются значения, которые соответствуют максимуму пероксидазной активности.
При выборе оптимальной концентрации белка ориентируются на такое значение, при котором не достигается максимум пероксидазной активности, так как работа вблизи максимума приводит к существенной ошибке даже при небольшом отклонении от заданной концентрации. Учитывая малый объем получаемых экстрактов, концентрация белка должна быть как можно ниже при максимально возможном значении пероксидазной активности. На графике зависимости пероксидазной активности от концентрации белка оптимальному значению концентрации белка соответствует середина плато. На этом участке пероксидазная активность мало зависит от концентрации белка.
Выбранные оптимальные параметры определения скорости реакций пероксидазного окисления о-дианизидина, гваякола и кониферилового спирта сводят в таблицу.
Таблица