Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

ЧЕЛЯБИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

III СЕМЕСТР

Методическое пособие для студентов

ФАКУЛЬТЕТ_____________________________

сТУДЕНТ_____________________________

ГРУППА_____________________________

ПРЕПОДАВАТЕЛЬ_____________________________

2007-2008

ЧЕЛЯБИНСК

2007-2008

нАСТОЯЩЕЕ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ СОЗДАНО КОЛЛЕКТИВОМ КАФЕДРЫ БИОХИМИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ. сОЗДАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ПОСОБИЯ БЫЛО ВЫЗВАНО НЕОБХОДИМОСТЬЮ - ПОМОЧЬ СТУДЕНТАМ В ОСВОЕНИИ СЛОЖНОГО ТЕОРЕТИЧЕСКОГО ПРЕДМЕТА - БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ.

в РАБОЧУЮ ТЕТРАДЬ ВНЕСЕНЫ ТЕМЫ ВСЕХ ЗАНЯТИЙ iii СЕМЕСТРА, ВНЕСЕНЫ ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ, ЧТО ЗНаЧИТЕЛЬНО ДОЛЖНО ОБЛЕГЧИТЬ ПОДГОТОВКУ СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ. сТУДЕНТ СМОЖЕТ ПОЗНАКОМИТЬСЯ ЗАРАНЕЕ С ТОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТОЙ, КОТОРУЮ ЕМУ ПРЕДСТОИТ ВЫПОЛНИТЬ. в НЕЙ СФОРМУЛИРОВАН ПРИНЦИП МЕТОДА, ЧТО ПОМОЖЕТ СТУДЕНТУ НЕ ПРОСТО ВЫПОЛНИТЬ РАБОТУ, НО И ОСМЫСЛИТЬ ее.

кАЖДОЕ ЗАНЯТИЕ ИМЕЕТ ПРИЛОЖЕНИЕ ЛИБО ОБЩЕЕ ДЛЯ ВСЕХ ФАКУЛЬТЕТОВ, ЛИБО ДЛЯ каждого факультета, ЧТО ЗНАЧИТЕЛЬНО ЭКОНОМИТ ВРЕМЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ НА ЗАНЯТИИ, ДАВАЯ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ И ЗАКРЕПЛЕНИЯ МАТЕРИАЛА.

сТУДЕНТ МОЖЕТ САМОСТОЯТЕЛЬНО ПРОВЕРИТЬ КАЧЕСТВО СВОЕЙ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ, РЕШИВ СИТУАЦИОННЫЕ ИЛИ ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ. нЕВОЗМОЖНОСТЬ ОТВЕТА НА ВОПРОСЫ ДОМАШНИХ ЗАДАНИЙ ДОЛЖНО НАСТОРОЖИТЬ СТУДЕНТА О НЕКАЧЕСТВЕННОЙ ПОДГОТОВКЕ МАТЕРИАЛА ПО ДАННЫМ ВОПРОСАМ.

жЕЛАЕМ УСПЕХА В ИЗУЧЕНИИ ПРЕДМЕТА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ!

Составители:

Цытович А.Л.

Соломатова Т.В.

Маляр К.В.

Чарная Л.Ф.

Крупицкая Л.И.

Горностаева А.Б.

Синицкий А.и. под ред. зав каф. Проф. Цейликмана В.Э.

Занятие 1

Химический состав и строение простых белков

Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения белков из мышечной ткани.

Проанализировать аминокислотный состав выделенных из мышечной ткани белков, используя цветные реакции на белки и аминокислоты.

Вопросы для самоподготовки

1. Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков.

2. Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный).

3. Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой, нингидриновой).

4. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков.

Практическая часть занятия

Биуретовая реакция

Принцип метода: реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса ионов меди с пептидной группировкой. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе, и является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы.

Ход работы: в пробирку наливают 1-2 мл раствора белка, добавляют 1-2 мл 10% раствора NaОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO₄.

Результат:

Вывод:

Нингидриновая рекция

Принцип метода: основан на том, при нагревании с a-аминокислотами, а также полипептидами нингидрин образует фиолетово-розоватое окрашивание. При нагревании с нингидрином аминокислоты подвергаются окислительному дезаминированию идекарбоксилированию, при этом выделяется углекислый газ, аммиак, образуется альдегид, восстановленный нингидрин конденсирует с аммиаком и окисленным нингидрином, образуя окрашенное соединение.

Ход работы: к 0,5 мл раствора белка добавить 5 капель 0,2 % водного раствора нингидрина и прокипятить 2-3 минуты.

Результат:

Вывод:

Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.

Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол СН₃СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.

Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.

Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.

Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А

Rf.= ----

Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.

Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.

На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55°С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.

Результат.

Вывод.

Домашнее задание:

1. Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы)

2. Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.

3. Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название.

4. Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных реакций и хроматографии.

Литература:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия . М. 2003

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2001

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998