Tрис-глициновый электродный буферный раствор 1Х
Состав: 25 мМтрис, 192 мМ глицин, 0.1% SDS, деионизированная вода.
Для приготовления электрофорезного буфера развести в десять раз трис-глициновый стоковый раствор в мерной колбе и добавить SDS до конечной концентрации 0.1%. Довести деионизированной водой до требуемого объема.
Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 100 мл трис-глицинового стокового раствора 10Х, 10 мл 10%-ногоSDS, деионизированная вода.
Разделяющий гель:
Состав: 62.5 мМтрис-НСl, рН 8.8, 46.5% бис-акриламид (30%, 29:1), 0.1% SDS, 0.5% персульфата аммония, 0.09% TEMED, деионизированная вода.
Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве
Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.74 мл деионизированной воды, 1.50 мл 1М трис-НСl, рН 8.8, 2.00 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 40 мкл 10%-ного раствора SDS, 20 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 4 мклTEMED.
Формирующий (концентрирующий) гель:
Состав: 62.5 мМтрис-НСl, рН 6.8, 26.85% бис-акриламид (30%), 0.1 % SDS, 0.94% персульфата аммония, 0.2% TEMED, деионизированная вода.
Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве
Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.8 мл деионизированной воды, 0.25 мл 1М Трис-НСl, рН 6.8, 0.4 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 20 мкл 10%-ного раствора SDS, 14 мкл 10%-ного раствора APS, 3 мклTEMED
2.4. Ход работы:
Для выполнения данной лабораторной работы рекомендуется использовать гребенки с 10 ячейками и спейсеры толщиной 0.75 мм. Ширина каждой ячейки – 6.5 мм. Максимальный объем образца – 30 мкл.
1. В качестве подготовки к лабораторной работе стеклянные пластины промывают мягким детергентом, ополаскивают достаточным объемом деионизированной воды и спирта, затем высушивают в вертикальном положении.
2. Рамку для заливки геля ставят в вертикальное положение зажимами вперед в открытом положении, затем собирают форму для геля – одно стекло – с приклеенным спейсером, второе – укороченное.
3. Форму берут таким образом, чтобы метки («up») на стекле со спейсером находились вверху и укороченное стекло ‑ спереди, и устанавливают в рамку для заливки геля. Следует убедиться, что нижние края обоих стекол находятся на одном уровне, после чего необходимо зафиксировать форму зажимами.
4. Собранную рамку устанавливают в стенд для заливки геля стеклянной формой вперед: упираясь нижним краем стекол в резиновую прокладку, подводят верхний край стекол под выступ на клипсе.
5. Затем вставляют гребенки между стекол: надписями вперед, пока выступ на гребенке не упрется в укороченное стекло. От дна ячеек отмеряют 1 см и отмечают это положение фломастером. Удаляют гребенку.
6. До этого уровня будет заливать разделяющий гель. После заливки разделяющего геля поверх него наслаивают 96% этиловый спирт (или деионизированную воду). Как только разделяющий гель заполимеризовался (это занимает примерно полчаса), спирт тщательно удаляют при помощи фильтровальной бумаги.
7. Заливают формирующий гель и устанавливают гребенку. Дают гелю полимеризоваться (это занимает примерно полчаса), и достают рамку из стенда для заливки геля.
8. Повернув защелки вперед извлекают кассету с гелем и вставляют в щели на дне электродной ячейки (укороченное стекло смотрит внутрь) и прижимают к зеленой прокладке. Следует убедиться, что укороченное стекло попадает в углубления на зеленой прокладке.
9. Вставляют кассеты с гелем и электродную ячейку в фиксирующую рамку. Надавливая сверху на электродную ячейку, защелкивают оба зажима на фиксирующей рамке, и опускают фиксирующую рамку в мини-резервуар.
10. Внутреннюю камеру заполняют трис-глициновым электродным буферным раствором, так чтобы его уровень располагался между верхними краями укороченного стекла и стекла со спейсером (для этого необходимо примерно 125 мл буфера) и добавляют примерно 200 мл трис-глицинового буфера в мини-резервуар.
11. Готовим образцы для электрофореза.
Приготовление образцов из телец включения, клеточной биомассы, нерастворимой фракции:
Центрифугируют 100мкл образца при 7000g в течении 10мин, тщательно удаляют полностью супернатант, затем добавляют к пробе 100мкл горячего буфера TES и прогревают образец в течение 5 мин при 99 0С. После чего добавляют к пробе 100мкл буфера Лэммли и снова прогревают образцы 5мин при 990С.
Приготовление растворимых белковых образцов:
Отбирают 100 мкл образца и добавляют к нему 100 мкл буфера Лэммли. Прогревают образцы в течение 5 мин при 99 0С.
Маркер молекулярных весов поставляется уже в готовом состоянии. Его необходимо только прогреть в течение 5 мин при 99 0С.
12. Наносят образцы в ячейки геля при помощи мини-шприца Гамильтона или дозатора с тонким носиком.
13. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 Вольт. Время электрофореза - примерно один час.
14. По окончании электрофореза отсоединяют ячейку Mini-Protean III от источника напряжения. Снимают крышку и осторожно достают фиксирующую рамку с электродной ячейкой и кассетами для геля, после чего сливают электрофорезный буферный раствор, открывают защелки фиксирующей рамки и достают электродную ячейку с кассетами для гелей.
15. Специальным шпателем разъединяют стеклянную форму для геля. Гель погружают в фиксирующий раствор (10%-ная уксусная кислота) и, осторожно покачивая, отсоединяют его от стекла.
16. Фиксируют гель в течение 30 мин при постоянном покачивании. После чего заливают его окрашивающим раствором. Для ускорения процесса окрашивания можно подогреть окрашивающий раствор вместе с гелем в микроволновой печи.
17. Когда интенсивность полос на геле перестает меняться, окрашивающий раствор необходимо слить, а гель промыть раствором 10%-ой уксусной кислоты. Раствор для отмывки также можно подогреть вместе с гелем в микроволновой печи. Это существенно ускоряет процесс отмывки.
18. Результаты электрофореза визуально анализируют по электрофореграмме, путем сравнения со стандартными образцами и маркером молекулярных весов.
Вопросы для самоконтроля
1. Какое свойство белковых молекул позволяет им образовывать отдельные зоны на электрофореграмме? От каких условий это свойство зависит и может изменяться?
2. Что такое суммарный заряд белковой молекулы? Почему он изменяется при изменении рН окружающей среды? Что такое pI?
3. Как будет изменяться суммарный заряд белковых молекул при проведении электрофореза в нативных и денатурирующих (SDS) условиях?
4. Подумайте, почему не следует выбирать электродные буферные растворы со значением рН, сильно (более чем на 4 ед) отличающимся от рI разделяемых белков?
5. Напишите структурную формулу полиакриламидного геля. Почему ПААГ считается лучшим носителем жидкой фазы?
6. Для чего при приготовлении геля используют следующие компоненты: персульфат аммония, акриламид, N,N′-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия, трис?
7. Для чего при приготовлении буфера Лэммли используют следующие компоненты: трис, β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, глицерин, метиленовый синий?
8. Подумайте, как можно повысить разрешающую способность электрофореза для более эффективного разделения препарата, состоящего из белков со следующими значениями молекулярной массы: 10 кДа, 18 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 36 кДа, 48 кДа, 79 кДа, 112 кДа, 220 кДа.
Список литературы
1. «Protein electrophoresis», GE Healthcare Biosciences resources (http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/ru/GELifeSciences/applications/electrophoresis/);
2. U. K. Laemmli. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227, 680-685.
3. H. Schagger, G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa// Anal. Biochem., 166, 368-379.
4. Э. Гааль, Г. Медбеши, Л. Верецкеи Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. – 448 с.
5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. – 463 с.
6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. – 288 с.
7. Д. Нельсон, М. Кокс. Основы биохимии Ленинджера. Том 1. М.: Бином, 2012. – 696 стр.
8. К. Уилсон, Д. Уолкер. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2013. – 848 с.
9. П. Ригетти. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир.1986. – 399 с.
[1]https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/capillary-electrophoresis/pa-800-plus-pharmaceutical-analysis-system/index.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/A66527///0/1//0/
[2] J. F. Sambrook and D. W. Russell, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp
[3] Р. Скоупс. Методы очистки белков. М., «Мир».1985. – 358 с.