Инициирование светом переноса электронов и протонов

В мембранах хлоропластов

В опытах Эмерсона Р. и др. (1957 г.) по изучению действия монохроматического света разной длины волны на интенсивность фотосинтеза у хлореллы было выяснено, что максимальная скорость фотохимических реакций наблюдается при одновременном освещении этих водорослей красным светом с длинами волн 650 нм и 680 нм, тогда как эффективность света каждой из указанных длин волн в отдельности оказалась более низкой. Обнаруженное явление в дальнейшем назвали эффектом Эмерсона. Оно позволило исследователям предположить о существовании в хлоропластах двух взаимодействующих между собой фотохимических систем – фотосистемы I и фотосистемы II, представляющих собой белково-пигментные копмлексы, которые в определённом порядке входят в структуру хлоропластных мембран. С помощью современных методов указанные белково-пигментные комплексы выделены из хлоропластов растений и достаточно хорошо изучены.

В состав белково-пигментного комплекса фотосистемы I входят:

димер пигмента Р₇₀₀ и мономер хлорофилла а₆₉₅, образующих реакционный центр;

светоулавливающий комплекс пигментов (около 300 молекул), включающий хлорофилл а с максимумами поглощения 675-695 нм, хлорофилл b и каротиноиды;

железо-серные белки, имеющие группировки атомов 4Fe4S.

Молекулы пигментов светоулавливающего комплекса поглощают кванты света, переходят в возбуждённое состояние и передают энергию возбуждения с помощью механизма индуктивного резонанса на пигмент Р₇₀₀, входящий в состав реакционного центра фотосистемы I. Молекула пигмента Р₇₀₀, находящаяся в возбуждённом синглетном состоянии, далее взаимодействует с первичным акцептором электронов хлорофиллом а₆₉₅, передавая ему один электрон. При этом пигмент Р₇₀₀ переходит в окисленное состояние (Р⁺₇₀₀) , а хлорофилл а₆₉₅ – в восстановленное состояние (а^-₆₉₅). Перевод пигмента Р₇₀₀ в исходное восстановленное состояние происходит за счёт передачи электрона из фотосистемы II, а у фотосинтезирующих бактерий источниками электронов для восстановления реакционного центра фотосистемы I используются электроны, образующиеся при окислении H₂S, H₂, углеводородов и других органических веществ.

Восстановленная форма хлорофилла а₆₉₅ передаёт электрон на вторичные акцепторы – железо-серные белки, которые в свою очередь способны восстанавливать водорастворимый железо-серный белок ферредоксин, обладающий подвижностью в жидкой дисперсионной среде на внешней поверхности тилакоидных мембран (рис. 32). Далее с участием фермента ферредоксин – НАДФ – редуктазы, содержащего в качестве кофермента ФАД, осуществляется перенос электронов от восстановленного ферредоксина на окисленный НАДФ (НАДФ⁺), в результате чего происходит образование одного из важнейших продуктов фотосинтеза – восстановленных динуклеотидов НАДФ (НАДФ×Н):

2Н⁺

2Fd_восст. + НАДФ⁺ ¾¾® 2Fd_окисл. + НАДФ×Н + Н⁺

редуктаза

Белково-пигментный комплекс фотосистемы II включает следующие компоненты:

димер пигмента Р₆₈₀ и феофетин, играющие роль реакционного центра;

светоулавливающий комплекс пигментов, в состав которого входят молекулы хлорофилла а с максимумами поглощения 670-683 нм, хлорофилл b и каротиноиды;

молекулы пластохинонов, служащие вторичными акцепторами электронов.

Как и в фотосистеме I, молекулы пигментов светоулавливающего комплекса фотосистемы II поглощают кванты света и передают энергию возбуждения на пигмент Р₆₈₀ в составе реакционного центра, переводя его в возбуждённое синглетное состояние. Возбуждённая молекула Р₆₈₀ становится донором электрона для первичного акцептора – молекулы феофетина, который переходит в восстановленное состояние и передаёт электрон на первичный пластохинон, действие которого как акцептора электрона усиливается железо-серной группировкой в составе белкового комплекса. От первичного восстановленного пластохинона электрон передаётся на вторичный пластохинон, который далее взаимодействует с липидорастворимым переносчиком электронов – димером пластохинона, не связанным с белковым комплексом фотосистемы II.

В хлоропластах растений найдено несколько разновидностей пластохинонов, которые могут функционировать в качестве переносчиков электронов. Все они являются производными бензохинона, имеющего боковой радикал в виде соединённых в цепь остатков изопрена, но различаются числом этих остатков и наличием гидроксилированных и ацилированных группировок. Так, например, пластохинон А имеет следующие строение:

окисленная форма восстановленная форма

Для перевода молекулы пластохинона в восстановленное состояние необходимо присоединить 2 электрона и два протона. Донором электронов для липидорастворимого пластихинона служит вторичный пластихинон, находящийся в структуре белкового комплекса фотосистемы II, а протоны присоединяются из стромы с внешней поверхности тилакоидной мембраны, прилегающей к той части белкового комплекса, в которой локализован вторичный пластихинон.

Учитывая, что липидорастворимый переносчик электронов функционирует в виде димера, реакция его восстановления может быть выражена следующим уравнением:

2PQ + 4ē + 4H⁺¾® 2PQ×H₂

Восстановление в исходное состояние пигмента Р₆₈₀ в реакционном центре фотосистемы II происходит за счет электронов, образующихся в результате фотоокисления молекул воды. В этом процессе участвуют специфические белки, содержащие катионы марганца и входящие в структуру белкового комплекса фотосистемы II. Один из таких белков содержит в активном центре четыре катиона Mn²⁺, способных легко переходить в окисленное состояние (Mn³⁺⁾ и отщеплять от молекул воды электроны, передавая их на другой белковый переносчик, содержащий два атома Mn, который далее осуществляет перенос электронов на окисленный пигмент Р₆₈₀, переводя его в исходное восстановленное состояние. Определено, что активность белка, взаимодействующего с молекулой воды, зависит от наличия в реакционной среде ионов Са²⁺ и Cl^-.

В результате фотоокисления молекулы воды разлагаются на кислород и катионы Н⁺ (протоны).

-4ē

2Н₂О ¾® О₂ + 4Н⁺

Кислород и протоны выделяются на внутренней поверхности тилакоидных мембран.

В передаче электронов от фотосистемы II на фотосистему I принимает участие белковый цитохромный комплекс, содержащий цитохромы b₆ и f, а также железо-серный белок Риске, имеющий активную группировку 2Fe2S. В составе белково-цитохромного комплекса есть участок связывания восстановленной формы липидорастворимого переносчика электронов 2PQ×H₂, при взаимодействии с которым переносчик подвергается окислению, отдавая электроны на железо-серный белок Риске и высвобождая протоны на внутренней поверхности тилакоидной мембраны:

-4ē

2PQ×H₂ ¾® 2PQ + 4H⁺

Восстановленный железо-серный белок Риске передает электроны на цитохром f, а последний далее восстанавливает водорастворимый низкомолекулярный (10500) белок – пластоцианин, содержащий медь. Атом меди в структуре этого белка соединён координационными связями с остатками цистеина, метионина (через атом S) и гистидина (через азот имидозольной группирровки).

Восстановленный пластоцианин способен перемещаться в жидкой дисперсионной среде на внутренней поверхности тилакоидной мембраны и переносить электроны от белкового цитохромного комплекса на окисленный пигмент Р₇₀₀ в составе реакционного центра фотосистемы I. Таким образом, в процессе взаимодействия двух фотосистем под действием света инициируется направленный поток электронов, образующихся в результате фотоокисления молекул воды, к реакционному центру фотосистемы I, а от него на ферредоксин, с участием которого синтезируются восстановленные динуклеотиды НАДФ×Н. Рассмотренная выше последовательность переноса электронов получила название нециклического транспорта электронов при фотосинтезе, который обычно изображается в виде так называемой Z-схемы (рис. 33).

Учитывая, что при фотоокислении воды 1 молекула кислорода (О₂) образуется из двух молекул воды, на реакционный центр фотосистемы II переносится 4 электрона, которые возмещают электронную недостаточность, вызванную передачей такого же количества электронов из реакционного центра в электронтранспортную цепь при поглощении 4 квантов света пигментным комплексом данной фотосистемы. Переносимые по электронтранспортной цепи фотосистемы II четыре электрона передаются далее на реакционный центр фотосистемы I для возмещения электронной недостаточности, вызванной передачей такого же количества электронов на восстановление НАДФ⁺ после поглощения четырех квантов света пигментным комплексом фотосистемы I. Всего при образовании 1 молекулы О₂ по электронтранспортной цепи, образующей Z-схему, осуществляется перенос 4 электронов, который индуцируется при поглощении восьми квантов света (4 в фотосистеме I + 4 в фотосистеме II), в результате чего осуществляется синтез двух молекул восстановленных динуклеотидов НАДФ×Н.

Следует отметить важную роль реакционных центров, в которых происходит превращение световой энергии, затраченной на возбуждение молекул пигментов, в химическую энергию восстановленных переносчиков электронов, возникающих при акцептировании электронов от пигментов Р₇₀₀ и Р_680.

Как было показано ранее, в процессе переноса электронов с участием липидорастворимого пластохинона и белково-цитохромного комплекса происходит также перенос протонов через мембрану тилакоида. Протоны акцептирует восстановленный липидорастворимый пластохинон с внешней поверхности тилакоидной мембраны, а их высвобождение происходит при взаимодействии восстановленного липидорастворимого пластохинона с белково-цитохромным комплексом уже в той части этого комплекса, которая обращена к внутренней поверхности тилакоидной мембраны. В результате на ней возникает избыточный положительный заряд, тогда как на внешней поверхности – отрицательный заряд, обусловленный избыточной концентрацией анионов, с которыми были связаны протоны. Кроме того, необходимо учитывать, что во внутренней полости тилакоидов остаются протоны, образовавшиеся в результате фотоокисления воды, которые также формируют положительный заряд на внутренней поверхности тилакоидной мембраны.

Накопление на внешней и внутренней поверхностях тилакоидной мембраны разноимённых зарядов, инициирует образование трансмембранного электрохимического потенциала, энергия которого может быть использована для осуществления эндергонических реакций синтеза веществ.

Наряду с нециклическим в хлоропластах растений происходит также и циклический транспорт электронов, который осуществляется с участием белкового комплекса фотосистемы I, белково-цитохромного комплекса с цитохромами b₆ и f, а также ферредоксина и липидорастворимого пластохинона PQ.

При циклическом транспорте электронов под действием света электроны из реакционного центра фотосистемы I через вторичные акцепторы – железо-серные белки – передаются на ферредоксин, который далее, взаимодействуя с белково-цитохромным комплексом, переносит их на пластохинон PQ (рис. 33). Восстановленный пластохинон акцептирует протоны с внешней поверхности тилакоидной мембраны и присоединяется к той части белково-цитохромного комплекса, где локализованы молекулы цитохрома b₆ . Передав электроны на молекулы цитохрома b₆, пластохинон окисляется и высвобождает протоны на внутреннюю поверхность тилакоидной мембраны и таким образом инициирует создание трансмембранного потенциала. От цитохрома b₆ электроны далее передаются с участием железо-серного белка Риске и цитохрома f на пластоцианин, который, передвигаясь в жидкой фазе на внутренней поверхности тилакоидной мембраны, переносит их на окисленный пигмент Р₇₀₀ в реакционном центре фотосистемы I, переводя его в исходное восстановленное состояние.

Таким образом, согласно циклической схеме при поглощении квантов света электроны от возбуждённой молекулы пигмента Р₇₀₀ в реакционном центре фотосистемы I передаются последовательно по указанной выше цепи переносчиков, инициируя образование трансмембранного потенциала, а затем снова возвращаются в реакционный центр. При этом не происходит образования восстановленных динуклеотидов НАДФ×Н.

Наличие в хлоропластах циклической системы переноса электронов можно легко обнаружить, если блокировать с помощью специального ингибитора дихлорфенилдиметилмочевины передачу электронов в фотосистему I из фотосистемы II. У фотосинтезирующих бактерий фотосистема II отсутствует и поэтому у них функционирует только система циклического транспорта электронов с участием фотосистемы I.

Белковые комплексы фотосистем I и II неравномерно распределены в хлоропластных мембранах. Белково-пигментный комплекс фотосистемы II больше локализован в мембранах, образующих граны, а более высокая концентрация белково-пигментного комплекса фотосистемы I наблюдается в ламеллах, окружённых стромой. Белково-цитохромный комплекс равномерно локализован как в гранах, так и ламеллах, не образующих структуру гран. Перенос электронов между белковыми комплексами осуществляют молекулы липидорастворимого пластохинона, а также водорастворимых белков ферредоксина и пластоцианина, способных перемещаться на поверхности мембран в жидкой фазе – строме.

Определённой подвижностью обладают и белковые комплексы, которые могут подвергаться фосфорилированию, в результате чего при диссоциации протонов возрастает их отрицательный заряд, вызывающий перемещение белкового комплекса к внутренней поверхности мембраны, имеющей положительный заряд. Такое перемещение в составе мембран белкового комплекса фотосистемы II способствует более быстрому переносу электронов на реакционный центр фотосистемы I. Фосфорилирование белковых комплексов катализируют ферменты киназы, которые активируются восстановленным пластохиноном и ингибируются окисленной формой пластохинона. В результате отщепления остатков фосфорной кислоты от белкового комплекса под действием соответствующих фосфатаз, уменьшается его отрицательный заряд и он возвращается в исходное состояние, после чего может снова подвергаться фосфорилированию.

Фотофосфорилирование

Кроме восстановленных динуклеотидов НАДФ×Н важнейшим продуктом фотохимических реакций является АТФ. В опытах с изолированными хлоропластами растений было показано, что под действием света у них индуцируется синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата:

свет

АДФ + Н₃РО₄ ¾¾® АТФ + Н₂О

хлоропласты

В отсутствие же света фосфорилирование АДФ не происходило. Исходя из этого исследователи сделали вывод, что эндергоническая реакция синтеза АТФ (∆G^º'= + 30,6 кДж/моль) сопряжена с использованием энергии поглощённых хлоропластами квантов света. Сопоставление стандартных окислительно-восстановительных потенциалов компонентов электронтранспортной цепи в мембранах хлоропластов показывает, что такой сопряжённый синтез АТФ возможен. Разница стандартных окислительно-восстановительных потенциалов первичного донора электронов реакционного центра фотосистемы II Р₆₈₀ и первичного акцептора электронов фотосистемы I а₆₉₅ составляет более 1,8 В, что обеспечивает перепад в изменении свободной энергии более 170 кдж/моль. Тогда как в стандартных условиях для образования 1 моля макроэргических связей при фосфорилировании АДФ затрачивается 30,6 кДж свободной энергии.

Однако при этом возникает вопрос, каким путём происходит превращение поглощённой при фотосинтезе световой энергии в химическую энергию макроэргических связей АТФ. В наибольшей степени механизм указанного превращения объясняет хемиосмотическая гипотеза, разработанная английским биохимиком П. Митчеллом в 1961-1966 г.г. Большинство положений этой гипотезы подтверждается экспериментами. Применение хемиосмотической гипотезы для объяснения механизма фотофосфорилирования было предложено в 1967 г. А. Ягендорфом и в настоящее время получило признание большинства исследователей.

11. Окислительно-восстановительные потенциалы основных компонентов цепи переноса электронов в хлоропластах (восстановленные формы)

Компоненты электронтранспортной цепи	Е°ˈ, В
П680 – донор электронов в реакционном центре фотосистемы II	+1,12
Феофетин – первичный акцептор электронов в реакционном центре фотосистемы II	–0,61
Первичный пластохинон в белковым комплексе фотосистемы II	–0,13-0,30
Вторичный пластохинон в белковом комплексе фотосистемы II	–0,01
Липидорастворимые пластохиноны	0…+0,10
Железо-серный белок Риске	+0,32
Цитохром f	+0,36-0,40
Пластоцианин	+0,37
Р700 – донор электронов в реакционном центре фотосистемы I	+0,40-0,45
а695 – первичный акцептор электронов в реакционном центре фотосистемы I	–0,73
Железо-серные белки в фотосистеме I	–0,50-0,55
Ферредоксин	–0,43
Ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктаза	–0,36
Цитохром b6	–0,18…+0,1

Согласно хемиосмотической гипотезе эндергонический процесс фосфорилирования АДФ с участием неорганического фосфата в хлоропластах растений сопряжён с использованием энергии трансмембранного электрохимического потенциала, который образуется при переносе электронов, индуцируемом в результате поглощения квантов света.

Процесс образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата катализирует АТФ-синтетазный белковый комплекс, получивший название сопрягающего фактора. Он состоит из 19 белковых субъединиц пяти типов, которые содержат участки связывания АДФ и неорганического фосфата. Сопрягающий фактор имеет глобулярную структуру и локализован на внешней поверхности тилакоидной мембраны. С сопрягающим фактором связан другой белковый комплекс, выполняющий функцию ионного канала, через который осуществляется транспорт катионов водорода Н⁺ по концентрационному градиенту из внутреннего пространства тилакоида на его поверхность. Проходя через ионный канал, катионы водорода попадают в АТФ-синтетазный комплекс и, активируя его, инициируют синтез АТФ (рис. 30).

Функционирование АТФ-синтетазного комплекса было проверено в экспериментах с изолированными от организма мембранными структурами. Так, например, в одном из опытов использовали искусственные мембраны, образованные из выделенных растительных фосфолипидов. С такими искусственными мембранными структурами связывали АТФ-синтетазу с соответствующим ионным каналом, выделенную из животных тканей, а в качестве хроматофора вводили бактериородопсин, который, поглощая кванты света, инициировал создание протонного градиента. Под действием протонного градиента АТФ-синтетазный комплекс катализировал синтез АТФ из добавленных в искусственную среду АДФ и неорганического фосфата.

При рассмотрении процессов фотофосфорилирования возникает также вопрос о количественном синтезе АТФ в расчёте на единицу поглощённой световой энергии или на 1 моль выделяющегося в ходе фотосинтеза кислорода. Как было указано ранее, при функционировании системы нециклического транспорта электронов одна молекула кислорода (О₂) образуется из двух молекул воды, подвергшихся фотоокислению. При этом внутри тилакоида остаются 4 протона (4Н⁺), а по электронтранспортной цепи фотосистемы II и фотосистемы I осуществляется перенос четырёх электронов, который инициируется в результате поглощения пигментными комплексами фотосистем I и II восьми квантов света (по 4 кванта каждой фотосистемой).

В процессе переноса указанных четырёх электронов по электронтранспортной цепи от белково-пигментного комплекса фотосистемы II на белково-цитохромный комплекс происходит восстановление и затем окисление липидорастворимого пластохинона, которое сопряжено с переносом четырёх протонов из внешнего матрикса во внутреннюю полость тилакоида. Таким образом, в результате переноса 4 электронов по системе нециклического транспорта во внутренней полости тилакоида накапливается 8 протонов, которые создают мембранный электрохимический потенциал. Как только энергия этого потенциала достигает определённой величины, начинает функционировать белковый ионный канал, по которому протоны движутся из внутренней полости тилакоида на внешнюю его поверхность, предотвращая дальнейшее увеличение трансмембранного потенциала.

Из ионного канала протоны поступают в АТФ-синтетазный белковый комплекс и в нём инициируют фосфорилирование АДФ с участием неорганического фосфата:

АДФ + Н₃РО₄ ¾¾® АТФ + Н₂О

Непосредственный механизм образования АТФ пока ещё окончательно не установлен. Наиболее вероятно, что на каждые 2 протона, поступающие в АТФ-синтетазный комплекс по ионному каналу, может синтезироваться 1 молекула АТФ. Если же учитывать, что в ходе образования 1 молекулы О₂ во внутренней полости тилакоида накапливается 8 протонов, а по электронтранспортной цепи переносится 4 электрона, то согласно указанному количественному выходу возможен синтез 4 молекул АТФ.

Однако не все протоны, выходящие через ионный канал на внешнюю поверхность тилакоида, участвуют в образовании АТФ, часть из них затрачивается на синтез восстановленных динуклеотидов НАДФ×Н, поэтому реальный выход АТФ при нециклическом транспорте электронов в расчёте на 1 молекулу образующегося О₂ составляет не 4 молекулы, а три или даже меньше.

Дополнительное количество АТФ в системе фотофосфорилирования может синтезироваться за счет функционирования циклического транспорта электронов, в ходе которого также осуществляется перенос протонов из внешнего матрикса во внутреннюю полость тилакоидов, вызывающий возникновение трансмембранного электрохимического потенциала, способного инициировать синтез макроэргических фосфатных связей АТФ в результате фосфорилирования АДФ с участим неорганического фосфата.

Образовавшиеся в ходе фотохимических реакций биоэнергетические продукты фотосинтеза НАДФ×Н и АТФ далее используются в фотосинтезирующих клетках для восстановления СО₂ до уровня углеводов, на синтез различных неуглеводных продуктов, транспорт веществ и другие эндергонические процессы, происходящие в листьях растений или в клетках и тканях других фотосинтезирующих организмов.

Темновая стадия фотосинтеза

В ходе темновых реакций фотосинтеза происходит эндергонический процесс образования углеводов из диоксида углерода (СО₂) и воды, в котором в качестве энергетических источников используются продукты световых реакций НАДФ×Н и АТФ. Последовательность химических превращений в темновой стадии фотосинтеза была выяснена американскими биохимиками М Кальвином, А. Бенсоном и Д. Басхемом в 1946-53 г.г. и впоследствии названа циклом Кальвина вследствие того, что открытые ими превращения имели циклический механизм. Все эти реакции протекают в строме – жидкой дисперсионной среде хлоропластов.

Для установления первичных продуктов, которые образуются при фотосинтезе из СО₂ и Н₂О, М. Кальвин и его сотрудники использовали культуру водорослей хлореллы, в которую вводили на свету меченный ¹⁴С СО₂ в виде Н₂¹⁴СО₃ и через короткие промежутки времени отбирали пробы клеток суспензии водорослей и фиксировали их метанолом. После этого из клеток хлореллы выделяли углеводы и другие органические вещества и в них определяли наличие радиоактивной метки, обусловленной включением в эти продукты ¹⁴С. При этом было установлено, что при коротких экспозициях (0,1-5 сек.) клеток водорослей в суспензионной среде, содержащей ¹⁴СО₂, большая часть радиоактивной метки обнаруживалась в карбоксильной группе 3-фосфоглицериновой кислоты. Последнее свидетельствовало о том, что фосфоглицериновая кислота является первичным продуктом фотосинтеза.

В дальнейшем с использованием радиоактивной метки в виде ¹⁴С и ³²Р было показано, что первичным акцептором, с которым взаимодействует СО₂ служит рибулозо-1,5-дифосфат. И эту реакцию катализирует фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза (4.1.1.39). Учитывая, что для образования карбоксильной группы кроме СО₂ требуется еще молекула воды, первую реакцию цикла Кальвина можно записать следующим образом:

	СН2О Р СН2О Р СООН (1) | | | С=О НО-С-Н + Н-С-ОН | + *СО2 + Н2О ¾¾® | | Н-С-ОН à СН2О Р *СООН СН2О Р | Ý | 2 молекулы Н-С-ОН С-ОН 3-фосфоглицериновой | || кислоты СН2О Р С-ОН рибулозо-1,5- | дифосфат Н-С-ОН | СН2О Р енольная форма     2 молекулы 3-фосфоглицериновой рибулозо-1,5- енольная форма кислоты дифосфат

Диоксид углерода в ходе реакции взаимодействует с енольной формой рибулозо-1,5-дифосфата, при этом образуется неустойчивый продукт – β–кетокислота, который под действием фермента гидролизуется, превращаясь в 3-фосфоглицериновую кислоту. При этом радиоактивный углерод обнаруживается в карбоксильной группе одной из двух синтезирующихся молекул 3-фосфоглицериновой кислоты.

Фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза в большом количестве содержится в хлоропластах растений (до 16 % от общего количества белков), а также в клетках зелёных и пурпурных бактерий. Он состоит из восьми пар неидентичных субъединиц и имеет большую молекулярную массу (560000). Для проявления каталитической активности этого фермента необходимо присутствие катионов Mg²⁺.

Рибулозодифосфаткарбоксилаза аллостерически активируется фруктозо-6-фосфатом и аллостерически ингибируется фруктозо-1,6-дифос-фатом, которые образуются при последующих превращениях в цикле Кальвина 3-фосфоглицериновой кислоты, являющейся продуктом действия данного фермента. Образовавшаяся под действием рибулозодифосфаткарбоксилазы 3-фосфоглицериновая кислота в последующих реакциях восстанавливается до альдегида.

Вначале молекула 3-фосфоглицериновой кислоты активируется путём фосфорилирования с участием АТФ. Эту реакцию катализирует фермент фосфоглицераткиназа (2.7.2.3), включающий 355 аминокислотных остатков и активируемый катионами Мg²⁺:

СООН О

‌ фосфоглицерат- ‖ (2)

Н–С–ОН + АТФ ¾¾¾¾¾® С– О~ Р + АДФ

‌ киназа |

СН₂О Р Н–С–ОН

|

СН₂О Р

3-фосфоглицериновая 1,3-дифосфоглицериновая

кислота кислота

Продукт реакции 1,3-дифосфоглицериновая кислота представляет собой макроэргическое соединение, имеющее высокое значение потенциала переноса фосфатной группы ( при гидролизе DGºˈ= 49 кДж×моль^-1), в связи с чем оно уже легко подвергается восстановлению в следующей реакции под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы (1.2.1.9) с участием восстановленной формы динуклеотида НАДФ×Н:

О О (3)

‖ триозофосфат- ‖

С–О~ Р дегидрогеназа С–Н

^‌ + НАДФ·Н + Н⁺ ¾¾¾¾¾® ‌ + НАДФ⁺ + Н₃РО₄

Н–С–ОН Н–С–ОН

| ‌

СН₂О Р СН₂О Р

1,3-дифосфоглице- 3-фосфоглице-

риновая кислота риновый альдегид

В ходе восстановительной реакции происходит синтез 3-фосфоглицерино-вого альдегида и отщепление от 1,3-дифосфоглицериновой кислоты минерального фосфата. Участвующие в синтезе 3-фосфоглицеринового альдегида АТФ и НАДФ×Н являются продуктами световой стадии фотосинтеза.

Как было показано ранее, в результате связывания одной молекулы СО₂ в первой реакции цикла Кальвина образуются 2 молекулы 3-фосфо-глицериновой кислоты, которые в ходе реакций 2 и 3 превращаются в две молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида, а последние довольно легко изомеризуются в фосфодиоксиацетон. Реакцию изомеризации катализирует фермент триозофосфатизомераза (5.3.1.1):

Н

^‌

С=О триозофосфат- СН₂ОН (4)

| ^¾¾¾¾® |

Н–С–ОН ^¾¾¾¾ С=О

| изомераза |

СН₂О Р СН₂О Р

3-фосфоглице- фосфодиокси-

риновый альдегид ацетон

Представленная реакция легко обратима, так как сопровождается небольшим изменением свободной энергии. Фермент триозофосфатизомераза отличается высокой молярной активностью (2800 кат×моль^-1 фермента для превращения в фосфодиоксиацетон).

Образовавшиеся триозофосфаты не накапливаются в хлоропластах. Под действием фермента альдолазы (4.1.2.13) они конденсируются, превращаясь во фруктозо-1,6-дифосфат:

Н СН₂О Р

‌ ‌ (5)

СН₂ОН С=О С=О

| | альдолаза ‌

С=О + Н–С–ОН ¾¾® НО–С–Н

| | |

СН₂О Р СН₂О Р Н–С–ОН

фосфодиокси- 3-фосфоглицери- |

ацетон новый альдегид Н–С–ОН

|

СН₂О Р

фруктозо-1,6-дифосфат

После этого от фруктозо-1,6-дифосфата происходит гидролитическое отщепление остатка фосфорной кислоты. Реакцию катализирует фермент фруктозо-1,6-дифосфатаза (3.1.3.11). В ходе этой реакции фруктозодифосфат превращается во фруктозо-6-фосфат:

СН₂О Р СН₂ОН (6)

| |

С=О фруктозо- С=О

| 1,6-дифос- |

НО–С–Н + Н₂О ¾¾¾® НО–С–Н + Н₃РО₄

| фатаза |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂О Р СН₂О Р

фруктозо-1,6-дифосфат фрутозо-6-фосфат

Фруктозо-1,6-дифосфатаза – активируемый светом фермент. Его активирование происходит с участием восстановленного под действием света ферредоксина, который совместно со специфическим белком переводит фруктозо-1,6-дифосфатазу в активное состояние. От действия этого фермента зависит интенсивность включения СО₂ в первой реакции цикла Кальвина. Если активность фруктозо-1,6-дифосфатазы низкая, то повышается концентрация фруктозо-1,6-дифосфата, который аллостерически ингибирует фермент рибулозодифосфаткарбоксилазу, вследствие чего понижается скорость первой реакции цикла Кальвина, катализируемой данным ферментом. А если фруктозо-1,6-дифосфатаза находится в активной форме, то повышается концентрация фруктозо-6-фосфата, являющегося аллостерическим активатором рибулозодифосфаткарбоксилазы. При таких условиях связывание СО₂ проходит с максимальной скоростью.

На следующем этапе фотосинтеза фермент транскетолаза (2.2.1.1) катализирует перенос концевого двууглеродного радикала, содержащего кетонную группу, от фруктозо-6-фосфата на 3-фосфоглицериновый альдегид, который образуется в результате присоединения к рибулозо-1,5-дифосфату ещё одной молекулы СО₂ и повторения реакций 2 и 3. В результате взаимодействия гексозы и триозы синтезируются новые углеводные продукты – эритрозо-4-фосфат и ксилулозо-5фосфат:

Н (7)

СН₂ОН Н ‌

| ‌ С=О СН₂ОН

С=О С=О | |

| | транскето- Н–С–ОН + С=О

НО–С–Н + Н–С–ОН ¾¾® | |

| | лаза Н–С–ОН НО–С–Н

Н–С–ОН СН₂О Р | |

| СН₂О Р Н–С–ОН

Н–С–ОН 3-фосфоглицери- эритрозо-4- |

| новый альдегид фосфат СН₂О Р

СН₂О Р ксилулозо-5-

фруктозо-6-фосфат фосфат

Ещё одна молекула 3-фосфоглицеринового альдегида, синтезированная в результате связывания второй молекулы СО₂, изомеризуется далее в реакции 4 в фосфодиоксиацетон, который затем соединяется с эритрозо-4-фосфатом, образуя седогептулозо-1,7-дифосфат. Эту реакцию катализирует фермент трансальдолаза (2.2.1.2):

Н СН₂О Р (8)

‌ |

СН₂О Р С=О С=О

| | трансальдо- |

С=О + Н–С–ОН ¾¾¾® НО–С–Н

| | лаза |

СН₂ОН Н–С–ОН Н–С–ОН

фосфодиоксиацетон | |

СН₂О Р Н–С–ОН

эритрозо-4-фосфат |

Н–С–ОН

|

СН₂О Р

седогептулозо-

1,7-дифосфат

СН2О Р СН2ОН (9) | | С=О С=О | фосфатаза | НО-С-Н + Н2О ¾¾¾® НО-С-Н + Н3РО4 | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | СН2О Р СН2О Р седогептулозо-1,7- седогептулозо-7- дифосфат фосфат

В следующей реакции происходит гидролиз седогептулозо-1,7-ди-фосфата, который катализирует специфическая фосфатаза. В ходе реакции от седогептулозо-1,7-дифосфата отщепляется остаток фосфорной кислоты и таким образом осуществляется синтез седогептулозо-7-фосфата:

После этого снова вступает в действие фермент транскетолаза, катализирующий перенос двууглеродного радикала с кетогруппой от седогептулозо-7-фосфата на 3-фосфоглицериновый альдегид, который синтезируется за счёт связывания в первой реакции цикла Кальвина уже третьей молекулы СО₂. Продукты реакции, катализируемой транскетолазой, – пятиугле-родные производные моносахаридов ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат: (10)

Н

СН₂ОН Н ‌

| ‌ СН₂ОН С=О

С=О С=О | |

| | транскетолаза С=О Н–С–ОН

НО–С–Н + Н–С–ОН ¾¾¾® | + |

| | НО–С–Н Н–С–ОН

Н–С–ОН СН₂О Р | |

| 3-фосфоглицери- Н–С–ОН Н–С–ОН

Н–С–ОН новый альдегид | |

| СН₂О Р СН₂О Р

Н–С–ОН ксилулозо-5- рибозо-5-

| фосфат фосфат

СН₂О Р

седогептулозо-7-

фосфат

В последующих реакциях цикла Кальвина осуществляется изомеризация фосфорнокислых производных пентоз, которая обеспечивает регенерацию первичного акцептора СО₂ – рибулозо-1,5-дифосфата. Образовавшиеся в реакциях 7 и10 молекулы ксилулозо-5-фосфата превращаются в рибулозо-5-фосфат под действием фермента рибулозофосфатэпимеразы (5.1.3.1), который способен изменять на противоположную пространственную ориентацию водорода и гидроксильной группы у третьего углеродного атома пентозы:

СН2ОН СН2ОН (11) | | С=О ¾¾¾® С=О | ¾¾¾ | НО-С-Н Н-С-ОН | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | СН2О Р СН2О Р ксилулозо-5- рибулозо-5-фосфат фосфат

Н (12) ‌ С=О СН2ОН | рибозофосфат- | Н-С-ОН ¾¾¾® С=О | ¾¾¾ | Н-С-ОН изомераза Н-С-ОН | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | СН2О Р СН2О Р рибозо-5-фосфат рибулозо-5-фосфат

Превращение рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат катализирует фермент рибозофосфатизомераза (5.3.1.6):

СН2ОН СН2О Р (13) | | С=О С=О | фосфорибулокиназа | Н-С-ОН + АТФ ¾¾¾® Н-С-ОН + АДФ | | Н-С-ОН Н-С-ОН | | СН2О Р СН2О Р рибулозо-5-фосфат рибулозо-1,5-дифосфат

Окончательную регенерацию первичного акцептора СО₂ осуществляет фермент фосфорибулокиназа (2.7.1.19), катализирующий фосфорилирование от АТФ рибулозо-5-фосфата:

В ходе указанных выше тринадцати реакций происходит включение в состав углеводных производных трёх молекул СО₂ и потребление трёх молекул первичного акцептора рибулозо-1,5-дифосфата, при этом осуществляется синтез шести молекул 3-фосфоглицеринового альдегида, из которых пять затрачиваются на регенерацию трёх молекул рибулозо-1,5-дифосфата и одна молекула 3-фосфоглицеринового альдегида остаётся как продукт темновой стадии фотосинтеза. Её синтез сопряжён с использованием биоэнергетических продуктов световой стадии фотосинтеза АТФ и НАДФ×Н.

Восстановленные динуклеотиды НАДФ×Н уча