УИРС. ТСХ – анализ производных фенотиазина.

Условия проведения ТСХ-анализа :

хроматографическая пластинка « Силуфол»

хроматографическая система: толуол – ацетон- этанол- аммиак (45: 45: 7,5: 7,5).

исследуемые вещества: хлороформные растворы фенотиазинов.

Обработка пластинки :

Н₂SO₄конц. в этаноле (1: 9 ) и нагревание в течение 10 минут.

После проведения исследования зарисовать полученную хроматограмму и рассчитать значения Rf .

ЗАНЯТИЕ № 13

ТЕМА:	Экспресс – диагностика наркотических и сильнодействующих веществ с использованием ТСХ-скрининга.
ЦЕЛЬ:	Сформировать целостную картину проведения экспресс – диагностики наркотических и сильнодействующих веществ. Обучить практическим навыкам ТСХ-скрининга.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ:

Основные термины и понятия:

Экспресс – диагностика. Предварительные пробы. Скрининг. ТСХ-скрининг.

Свидетели (метчики), ТСХ – пластинки, ТСХ – системы (общие и частные). Rf – основная качественная характеристика ТСХ. Реагенты для обнаружения веществ кислого и основного характера. ТСХ-анализ биожидкостей. Система Toxi-Lab.

Логическая структура темы:

ЭКСПРЕСС – ДИАГНОСТИКА НАРКОТИЧЕСКИХ И СИЛЬНОДЕЙСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ
Методы
Экспресс – тесты (предварительные пробы	ТСХ-скрининг	ГЖХ-скрининг	ИХА
ТСХ - скрининг
Системы растворителей	ТСХ пластинки
частные на барбитураты бензол-этилацетат (2:1) хлороформ-изопропанол-аммиак (5:5:1) на опиаты этилацетат-этанол-аммиак (9:1:0,5) на эфедрин и эфедрон метанол-аммиак (49:1) бензол-диэтиламин-этанол (9:1:1) на фенотиазины бензол-диоксан-аммиак (6:3,5:0,5) на 1,4-бензодиазепины хлороформ-ацетон (9:1) бензол на каннабино-иды петролейный эфир-диэтиловый эфир (9:1)бензол	общие для веществ основного характера толуол-ацетон-этанол-аммиак (45:45:7,5:2,5) диоксан-хлороформ-ацетон-аммиак (47,5:45:5:2,5) метанол-аммиак (100:1,5) для веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера хлороформ-ацетон (9:1) этилацетат-метанол-аммиак ( 80:10:5)	Сорбфил» «Силуфол» «Армсорб» ВЭТСХ Способы нанесения реактивов -опрыскивание -капельно - окунание Реагенты-проявители для веществ основного характера: нингидрин железа хлорид реактив Драгендорфа по Мунье реактив Марки реактив Манделина FPN-реактив Реагенты-проявители для веществ кислого и нейтрального характера: железа хлорид ртути нитрат дифенил-карбазон фурфурол иодплатинат Качественная характеристика-Rf Факторы, влияющие на её воспроизводимость
Оценка результатов исследований
Подтверждающие реакции и методы.
Микрокристаллические реакции
ГХ/МС,ВЭЖХ

Литература для самоподготовки:

1.Крамаренко,В. Ф. Токсикологическая химия[Текст]/ В.Ф.Крамаренко. – Киев: Выща школа, 1989.-С. 20 – 22..

2. Токсикологическая химия [Текст] / Под ред. Т.В.Плетенёвой.- М.:ГОЭТАР-МЕД, 2005.-С.187-193.

3.Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов в биосредах человека [Текст] / Под ред. Н.И.Калетиной.-М.: ГОЭТАР-МЕД,2007 –C. 325-355.

3. Ерёмин, С. К. Анализ наркотических средств [Текст]: руководство по химико - токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / С.К. Ерёмин, Б.Н.Изотов, Н.В. Веселовская.-М.: Мысль, 1993.-С. 65-75, 99-120.

4.Материалы лекций.

Вопросы для самоподготовки:

1. Какие биологические объекты обычно исследуют при экспресс-диагностике наркотического опьянения?

2. Какие методы анализа и типы реакций используются в экспресс-диагностике наркотических и сильнодействующих веществ?

3. Опишите общую схему изолирования наркотических и сильнодействующих веществ из биожидкостей?

4. Какие системы, пластинки и реагенты используют в ТСХ-скрининге веществ, вызывающих одурманивание?

5. Какие факторы влияют на воспроизводимость значений Rf?

6. По какой схеме проводят ТСХ-скрининг веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера?

7. По какой схеме проводят ТСХ-скрининг веществ основного характера?

8. Как проводится ТСХ-анализ в системе Токси-Лаб ?

Тестовый контроль по теме:

ТЗ 1. Реактив, используемый для предварительного обнаружения фенотиазинов в моче:

1. FPN – реактив.

2. Марки.

3. Манделина.

4. Драгендорфа.

5. Нингидрин.

ТЗ 2. Реакция, используемая в качестве предварительной пробы на наличие хинина в моче:

1. Таллейохинная проба.

2. Эритрохинная проба.

3. Реакция флюоресценции.

4. С роданидом аммония.

5. С реактивом Драгендорфа.

ТЗ 3. Название основной качественной характеристики тонкослойной хроматографии ………………… .

ТЗ 4. Название эталонного вещества сравнения, используемого в ТСХ для идентификации компонентов анализируемых проб ………………. .

ТЗ 5. Реагент – проявитель для обнаружения первичных аминов в ТСХ – скрининге.

1. Реактив Ван-Урка

2. Пикриновая кислота.

3. Сульфат ртути.

4. Нингидрин.

5. Прочный синий Б.

ТЗ 6-7.Установите соответствие:

Вещество Реагент – проявитель в ТСХ – скрининге:

1. Барбитал. 2. Папаверин.

А. Нингидрин. Б. HgSO₄ и дифенилкарбазон. В. Прочный синий Б. Г. Хлорид железа (III). Д. Реактив Драгендорфа по Мунье.

ТЗ 8. Реагент – проявитель для обнаружения барбитуратов в ТСХ – скрининге:

1. Марки.

2. Нингидрин.

3. FPN – реактив.

4. Драгендорфа по Мунье.

5. Сульфат ртути.

ТЗ 9. Реагент, используемый для обнаружения веществ нейтрального характера в ТСХ – скрининге:

1. FPN – реактив.

2. Нитрат ртути.

3. Реактив Драгендорфа.

4. Реактив Манделина

5. Фурфурол.

ТЗ 10. Группа веществ, определяемая реакцией с хлоридом железа и реактивом Марки

1. Фенилалкиламины.

2. 1,4-бензодиазепины.

3. Фенотиазины.

4. Производные ПАБК

5.Производные пиразолона

СОДЕРЖАНИЕ АУДИТОРНОГО ЗАНЯТИЯ:

1. Семинар по теме занятия.

2. Практикум .

3. Оформление протокола практического занятия.

4. Тестовый контроль усвоения темы.

ПРАКТИКУМ.

1.УИРС. ТСХ-скрининг веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера.

Хроматографическую пластинку делят на две части . В первой части наносят пробу исследуемого извлечения и метчик –спиртовой раствор фенацетина. Во второй части наносят пробу исследуемого извлечения и метчики - спиртовые растворы барбитала, антипирина и кофеина.

Хроматографирование проводят в системе хлороформ – ацетон (9:1).

Высушенную пластинку исследуют в УФ свете. Первую часть закрывают стеклом. Вторую часть проявляют сульфатом ртути и дифенилкарбазоном в хлороформе (барбитураты). После обесцвечивания фона при нагревании пластинку опрыскивают последовательно:

1) 5% раствором хлорида железа (салицилаты, антипирин, анальгин);

2) реактивом Драгендорфа по Мунье (алкалоиды);

3) конц. серной кислотой в этаноле.

Первую часть обрабатывают разбавленной азотной кислотой и нагревают в сушильном шкафу.

При отсутствии пятен в пробах исследуемого извлечения делают вывод об отсутствии тех или иных групп веществ. При положительном результате вычисляют Rf, определяют принадлежность к определённой хроматографической зоне , проводят ТСХ-анализ в частных системах, а также подтверждают наличие веществ микрокристаллическими и цветными реакциями.

2.УИРС. ТСХ-скрининг веществ основного характера.

На хроматографическую пластинку делят на три части. В каждую наносят пробу исследуемого извлечения и метчики : в 1-ю и 2-ю-спиртовой раствор аминазина, в 3-ю- спиртовые растворы аминазина, антипирина, хинина и папаверина.

Хроматографирование проводят в системе толуол–ацетон-этанол-25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5).Пластинку высушивают и исследуют в УФ свете. Затем части пластики 1и2 закрывают стеклом или отрезают.

Проявление пятен в третьей части проводят последовательно:

1) 5% раствором хлорида железа (производные пиразолона, фенотиазина, морфин);

2) конц. серной кислотой в этаноле;

3) реактивом Драгендорфа по Мунье (алкалоиды).

Первую часть пластинки обрабатывают реактивом Марки капельно,вторую часть–концентрированной серной кислотой.

При отсутствии пятен в пробах исследуемого извлечения делают вывод об отсутствии тех или иных веществ. При положительном результате вычисляют Rf, определяют принадлежность к определённой хроматографиечской зоне, проводят ТСХ-анализ в частных системах, а также подтверждают наличие веществ микрокристаллическими и цветными реакциями.

ЗАНЯТИЕ № 14

ТЕМА:	Иммунохимический анализ (ИХА) – как метод диагностики острых отравлений и наркотического опьянения.
ЦЕЛЬ:	Рассмотреть основные принципы и методы иммунохимического анализа. Сформировать знания по проведению ИФА наркотических средств.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ:

Основные термины и понятия:

Иммунохимический анализ (ИХА). Антитело, моно- и поликлональные антитела, антиген (гаптен), антигенные детерминанты, антисыворотка, иммунная реакция. Классификация методов ИХА. Способы детектирования. РИА, ИФА, ПФИА. Гомогенный, гетерогенный и гомогенно-гетерогенный ИФА. Ферменты, используемые в ИФА. Достоинства и недостатки методов ИФА.

Логическая структура темы:

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Основные понятия
Антитела	Антигены гаптены	Антисыворот- ка	Иммунная реакция АТ-АГ
Моноклональные антитела Поликлональные антитела	Антигенные детерминанты (эпитопы)
КЛАССИФИКАЦИЯ
МЕТОД	СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
Радиоиммунный анализ РИА Иммуноферментный анализ ИФА Поляризационный флюороиммуноанализ ПФИА Люминесцентный иммуноанализ ЛИА Спин-иммунологический анализ СИА Вироиммуноанализ ВИА Металлоимуноанализ МИА Иммуноанализ с помощью частиц и иммунодиффузия ИД Нефелометрические иммунометоды Иммуносенсорные методы	Радиактивность Ферментная активность Интенсивность флюоресцентной поляризации Интенсивность люминесценции Электронный спин-резонанс свободных радикалов Цитолиз бактериофагов Атомные спектры поглощения Турбодиметрия Преломление света Электрический сигнал
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
по технике выполнения	гомогенный
гетерогенный
гомогенно-гетерогенный
по типу иммунохимической реакции	конкурентный
неконкурентный (ингибиторный)
сэндвич-анализ
ФЕРМЕНТЫ
Гомогенный ИФА	Гетерогенный ИФА
лизоцим белка куриных яиц глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа малатдегидрогеназа	пероксидаза хрена b-галактозидаза глюкоамилаза глюкооксидаза ацетилхолинэстераза щелочная фосфатаза каталаза печени
МЕТОДЫ РЕГИСТРАЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА
Фотометрический Флюориметрический Хемилюминесцентный Электрохимический Турбидиметрический
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Наркотические и некоторые сильнодействующие вещества

Литература для самоподготовки:

1. Токсикологическая химия [Текст] / Под ред. Т.В.Плетенёвой.- М.:ГОЭТАР-МЕД, 2005.-С.252-263.

2.Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов в биосредах человека [Текст] / Под ред. Н.И.Калетиной.-М.: ГОЭТАР-МЕД,2007 –C. 280-321.

4.Материалы лекций.

Вопросы для самоподготовки:

1. Какая реакция лежит в основе иммунохимического анализа?

2. Какие Вы знаете классификации методов ИХА?

3. Перечислите способы детектирования, используемые в ИХА.

4. Какие методы ИХА наиболее часто применяются для диагностики наркотического опьянения?

5. Как проводится гомогенный и гетерогенный ИФА?

6. Какие ферменты используются в гетерогенном и гомогенном ИФА?

7. Перечислите достоинства и недостатки ИФА, РИА, ПФИА.

Тестовый контроль по теме:

ТЗ 1. Название реакции, лежащей в основе методов иммунохимического анализа ……………………….. .

ТЗ 2. Методы иммунохимического анализа имеют ……………. судебно – химическое значение.

ТЗ 3-4.Установите соответствие:

Название метода: Способ детектирования:

1. Иммуноферментный А. Радиактивность.

анализ. Б. Ферментная активность.

2. Поляризационный В. Интенсивность люминесценции.

флюороиммунный Г. Турбодиметрия.

Анализ. Д. Интенсивность поляризации

флуоресценции

ТЗ 5. Название типа иммуноферментного анализа, в котором все компоненты находятся в растворе …………………….. .

ТЗ 6. Название типа иммуноферментного анализа, в котором один из компонентов иммобилизирован на твёрдом носителе ………………………. .

ТЗ 7. Метод определения ферментативной активности в ИФА:

1. Фотометрия.

2. Поляриметрия.

3. Титриметрия.

4. Полярография.

5. ИК- Спектрофотометрия.

ТЗ 8. Название стадии разделения реагирующих компонентов в гетерогенном ИФА …………………………………. .

ТЗ 9-10.Установите соответствие:

Тип ИФА Метчики – ферменты

1. Гомогенный. А. Пероксидаза.

2. Гетерогенный. Б. Алкогольдегидрогеназа.

В. Лизоцим.

Г. Глюкуронилтрансфераза.

Д. Альдегидгидроксидаза.

СОДЕРЖАНИЕ АУДИТОРНОГО ЗАНЯТИЯ :

1. Семинар по теме занятия:

1.1. Основные принципы ИХА.

1.2. Классификация методов ИХА. Методы детектирования.

1.3. Основные принципы и методы ИФА. Особенности гомогенного, гетерогенного и гомогенно-гетерогенного анализов.

1.4. Достоинства и недостатки методов ИХА наркотических средств.

2. Тестовый контроль усвоения темы.

ЗАНЯТИЕ № 15

ТЕМА:	Контрольная работа №3. Решение экспертной задачи. Выделение.
ЦЕЛЬ:	Сформировать знания и практические навыки проведения изолирования ядовитых и сильнодействующих веществ из биологического материала методом экстракции полярным растворителем.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ:

На основании полученных знаний и практических навыков составьте схему изолирования ядовитых и сильнодействующих веществ из биологического материала методом экстракции подкисленной водой (метод Васильевой).

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Общие принципы качественного химико-токсикологического анализа.

2.Общие принципы количественного химико-токсикологического анализа. ГЖХ методы в анализе ядовитых веществ.

3.Скрининг-анализ. ТСХ-скрининг ядовитых и наркотических веществ при проведении судебно-химической (химико-токсикологической) экспертизы.

4.Иммунохимические методы анализа наркотических и сильнодействующих веществ.

5.Фотометрические методы анализа ядов( на примере анализа барбитуратов и 1,4-бензодиазепинов).

6.Производные фенилалкиламина. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

7.Каннабиноиды. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

8.Производные барбитуровой кислоты. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

9.Производные 1,4-бензодиазепина. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

10.Производные фенотиазина. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

11.Производные п-аминобензойной кислоты. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

12.Производные пиразолона. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико-токсикологического анализа.

13.Производные п-аминофенола. Токсикологические и физико-химические свойства. Особенности изолирования и химико- токсикологического анализа

14.Введение в наркологию. Наркотическое средство, его фармакологические. социальные и правовые характеристики. Наркомания, токсикомания. Организации, осуществляющие контроль за незаконным оборотом наркотиков и их употреблением.

15. Общая характеристика методов детоксикации организма при острых отравлениях.

16.Методы усиления естественных путей детоксикации организма. Очищение ЖКТ. Целесообразность и эффективность. Способы многократного промывания желудка, их обоснование.

17.Методы форсированного диуреза и его применение.

18.Метод гипервентиляции и вызывания рвоты. Целесообразность их применения.

19.Основные методы искусственной детоксикации организма. Диализ. Характеристика метода. Гемодиализ.

20.Перитониальный диализ. Классификация. Принцип действия.

21.Сорбция. Типы сорбентов, применяемые для очистки крови. Основные требования к ним и их эффективность. Гемосорбция. Характеристика метода.

22.Обменное переливание крови (замещение). Принцип метода, эффективность, недостатки, применение.

23.Детоксикация организма с помощью антидотов (противоядий). Привести примеры основных антидотов. При каких отравлениях они применяются? Эффективность антидотной терапии.

Литература для самоподготовки :

1.Лужников Е.А. Клиническая токсикология[Текст] / Е.А.Лужников.- Изд. 3-е, перераб.и доп.- М.: Медицина, 1999.-С. 69-135, 256-276.

2.Крамаренко,В. Ф. Токсикологическая химия[Текст]/ В.Ф.Крамаренко. – Киев: Выща школа, 1989.-С. 34-87, 172-296, 88-100.

3.Швайкова, М.Д. Токсикологическая химия [Текст] / М.Д.Швайкова. – М.: Медицина, 1975.-С. 119-246.

4.Белова, А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии [Текст] / А.В.Белова. - Изд. 2-е, исправ.-М.:-Медицина,1976.-С. 56-131.

5.Якушева Н.Ю., Минаева Н.Н. Сборник вопросов и задач по токсикологической химии. [Текст] Учебное пособие / Н.Ю.Якушева, Н.Н.Минаева – Х : ДВГМУ , 2007 .-С.118-126.

6. Токсикологическая химия [Текст] / Под ред. Т.В.Плетенёвой.- М.:ГОЭТАР-МЕД, 2005.-С. 187-193,252-263, 275-280,305-311.

7.Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов в биосредах человека [Текст] / Под ред. Н.И.Калетиной.-М.: ГОЭТАР-МЕД,2007 –C. 222-236, 280-321, 325-355, 571-586,614-679.

8. Ерёмин, С. К. Анализ наркотических средств [Текст]: руководство по химико - токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / С.К. Ерёмин, Б.Н.Изотов, Н.В. Веселовская.-М.: Мысль, 1993.-С. 6-8, 17-53, 65-148.

9.Материалы лекций.

СОДЕРЖАНИЕ АУДИТОРНОГО ЗАНЯТИЯ:

1.Проведение рубежного тестового контроля.

2.Контрольная работа № 3.

3.Проведение студентами изолирования ядовитых и сильнодействующих веществ из биологического материала.

4.Оформление протокола занятия.

ПРАКТИКУМ