Методы выделения и очистки белков

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации: происходит разрушение нативной структуры белков, приводящее к потере некоторых природных свойств, например, растворимости, биологической активности. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционированияи очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. В клинической практике этот метод используют для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различной подвижности белков в электрическом поле в зависимости от значений рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). В клинических лабораториях хроматографию применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

Различают следующие виды хроматографии:

- адсорбционная– компоненты смеси разделяются в зависимости от их сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза является опорой для стационарной жидкой фазы (бумажная хроматография);

- ионообменная - используют ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются из колонки;

- гель-хроматография или метод молекулярных сит позволяет разделить белки с разной молекулярной массой: небольшие молекулы проникают в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой через хроматографическую колонку.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Структурная функция. В комплексе с липидами белки участвуют в образовании биомембран клеток. Структурные белки цитоскелета придают форму клеткам и многим органоидам. Примерами структурных белков являются коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже.

Сократительная (двигательная) функция.Сократительная функция присуща мышечным белкам (актин и миозин). Белки цитоскелета необходимы для расхождения хромосом в процессе митоза.

Питательная (резервная) функция. Белки яйца (овальбумины) - источники питания для плода. Основной белок молока (казеин) также выполняет питательную функцию.

Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов (биологических катализаторов) является белками.

Транспортная функция. Белок эритроцитов гемоглобин участвует в переносе кислорода и углекислого газа, выполняя дыхательную функцию. Альбумины сыворотки крови участвуют в транспорте липидов.

Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков синтезируются защитные белки - антитела (иммунная защита). Ряд белков плазмы крови способны к свертыванию, что предохраняет от кровопотери при ранениях (физическая защита).

Гормональная функция. Группа гормонов представлена белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы инсулин.

Рецепторная функция. Клеточные белки образуют специфические рецепторы и участвуют в передаче гормонального сигнала.

Другие важные функции белков - способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, обеспечивающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.