Методы выделения и очистки белков
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков такова: измельчение биологического материала (гомогенизация), извлечение белков (перевод их в растворенное состояние ‒ экстракция), выделение исследуемого белка из смеси других (очистка и получение индивидуального белка).
Обычные методы органической химии, применяемые для выделения веществ из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.) для белков неприемлемы, т.к. белки чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). При повышении температуры белки подвергаются денатурации (теряют нативные свойства, в частности, растворимость, биологическую активность), поэтому разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.
Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга.
Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс называют фракционированием.
На каждой стадии разделения белок должен находиться либо в виде раствора, либо в виде осадка.
Для осаждения с помощью дегидратации необходимо понизить растворимость белка. Растворимость белка зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на поверхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению белка. В качестве таких растворителей используют ацетон. Осаждают белки также с помощью солей, например сульфата аммония. Этот метод основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных атмосфер, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.
При изоэлектрическом осаждении заряд белков обусловлен остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.
При центрифугированиивыпавший осадок белка можно выделить фильтрованием. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 105g (т.е. 105 ускорений свободного падения), что позволяет осаждать даже некоторые крупные надмолекулярные агрегаты ‒ рибосомы и вирусы.
Сорбцияоснована на различном сродстве компонентов смесей к определенным веществам ‒ сорбентам. Наиболее часто используемый сорбент ‒ гель фосфата кальция (гидроксиапатит), или активированный уголь. Эффективную сорбцию можно получить на ионитах-сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорбции на ионитах происходит обмен этих противоионов. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, он связывает катионы и его называют катионитом. Соответственно сорбент с положительно заряженными группами называют анионитом. В качестве ионитов (после соответствующей химической обработки) чаще всего используют материалы на гидрофильной основе: целлюлозе, декстране, силикагеле или пористых стеклах.
Молекулярные сита представляют собой материалы с очень маленькими порами определенного размера. Следует отметить отличие этих «сит»: крупные частицы не остаются на поверхности материала «сита», а обтекают его частички (гранулы), тогда как мелкие вещества примесей диффундируют в частицы сита и таким образом задерживаются. Материалом для молекулярных сит могут служить сефадекс (полисахарид декстран, у которого после соответствующей обработки цепи оказываются сшитыми трехуглеродными мостиками) или полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками.
При перечисленных методах в конечной смеси остаются вспомогательные низкомолекулярные вещества ‒ органические растворители, соли и кислоты. Для очищения от них используется метод диализа. Он основан на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для белков. Чаще всего с этой целью используют пленки из целлофана (нитрат целлюлозы). В лаборатории подлежащий диализу раствор белка помещают в мешок из целлофана и погружают в сосуд с водой. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному переходу в него всех проходящих через целлофан веществ, а белки остаются внутри.