Раздел iii. прикладные аспекты биохимии

ГЛАВА 5. БИОХИМИЯ В ТЕХНОЛОГИИ

БРОЖЕНИЕ МОЛОЧНОГО САХАРА

В основе изготовления целого ряда продуктов лежат процессы глубокого распада сахаров под действием мик­роорганизмов, называемые брожением. Вместе с тем процессы бро­жения могут быть причиной порчи пищевых продуктов (из­лишняя кислотность, вспучивание творога, сметаны, сыра и т.д.). Существует несколько типов брожения, в частности молочного сахара – лактозы, различающихся сос­тавом конечных продуктов.

Начальным этапом почти всех типов брожения является расщеп­ление олиго- и полисахаров до мономерных звеньев: молочного сахара – на глюкозу и галактозу под влиянием фер­мента лактазы b-галактозидазы; сахарозы – на глюкозу и фруктозу, под влиянием фермента сахаразы; мальтозы – на два остатка глюкозы, под влиянием фермента мальтазы и т.п.. Далее брожению подвергается глю­коза или фруктоза. Галактоза не сбраживается или ферментируется слабо, обычно при участии уридиндифосфатглюкозы она переходит в глюкозо-1-фосфат, который после изомеризации в глюкозо-6-фосфат вклю­чается в схему превращения глюкозы:

_{галактокиназа}

Галактоза + АТФ Галактозо-1-фосфат + АДФ

_{гексозо-1-фосфатуридилтрансфераза}

Галактозо-1-фосфат + УДФ-глюкоза

УДФ-галактоза + глюкозо-1-фосфат

_{УДФ-глюкозо-4-эпимераза}

УДФ-галактоза УДФ-глюкоза

Некоторые микроорганизмы могут сбраживать непосредственно лактозу, переводя ее в фосфорные эфиры.

Все типы брожения до образования пировиноградной кислоты идут с получением одних и тех же промежуточных продуктов и по одному и тому же пути — пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Дальнейшие пре­вращения пировиноградной кислоты могут идти в разных направле­ниях, которые будут определяться специфическими особенностями данного микроорганизма и условиями среды. Конечными продукта­ми брожения могут быть молочная, уксусная, пропионовая, масляная кислоты, спирт, ароматические вещества, диоксид углерода и другие соединения. Всем истинным процессам брожения свойственно общее правило: восстановленная на первой стадии форма НАД (за счет окис­ления 3-фосфоглицеринового альдегида) снова окисляется на второй стадии, передавая водород любому акцептору. Это может быть пировиноградная кислота, ацетилфосфат, ацетальдегид, диацетил, ацетоин и т.д. Таким образом, наблюдается сопряжение стадий окисления и восстановления с точным соблюдением эквивалентности.

Молочнокислое брожение

Молочнокислое брожение глюкозы является основным процес­сом при изготовлении заквасок, сыра и кисломолочных продуктов, а молочнокислые бактерии — наиболее важной группой микроорга­низмов для молочной промышленности. Процесс молочнокислого брожения каждой гексозы молочного сахара выражается суммарным уравнением

С₆Н₁₂О₆ + 2Ф_Н + 2АДФ ¾¾¾¾® 2С₃Н₆О₃ + 2АТФ + Н₂О.

Наряду с молочной кислотой могут образовываться и побочные продукты брожения.

Молочнокислые бактерии по характеру продуктов сбраживания глюкозы относят к гомоферментативным или гетероферментативным. Гомоферментативные бактерии, как показывает их название, обра­зуют главным образом молочную кислоту (более 90%) и лишь незна­чительное количество побочных продуктов. Гетероферментативные бактерии около 50% глюкозы превращают в молочную кислоту, а ос­тальное количество — в этанол, уксусную кислоту и СО₂. Однако про­вести резкую границу между гомо- и гетероферментативными молоч­нокислыми бактериями по образующимся продуктам брожения иног­да бывает трудно. Так, отмечены факты образования отдельными штаммами гомоферментативных молочнокислых бактерий от 8 до 30% побочных продуктов, а гетероферментативные бактерии под воздействием ряда факторов могут вести себя как гомоферментативные.

Более характерным признаком при делении молочнокислых бак­терий на группы является путь сбраживания глюкозы. Гомоферментативные бактерии сбраживают глюкозу по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, гетероферментативные — пентозофосфатным путем.

Гомоферментативное молочнокислое броже­ние. Механизм гомоферментативного молочнокислого брожения глюкозы к настоящему времени изучен подробно. Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту идет в ре­зультате последовательных реакций гликолиза (см. стр. 101). В заключительной реакции пировиноградная кислота восстанавли­вается до молочной кислоты под действием фермента лактатдегидрогеназы. Роль восстановителя при этом играет НАДН^.Н⁺, образовавшийся в реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида (см. рис. 4.8).

Следовательно, при гомоферментативном молочнокислом броже­нии из 1 моля глюкозы образуются 2 моля молочной кислоты (с од­новременным синтезом 2 моля АТФ).

При сбраживании глюкозы молочнокислыми бактериями могут образоваться два оптических изомера молочной кислоты: левовращающий D(-)-лактат и правовращающий L(+) лактат:

D(+)-лактат L(-)-лактат

Изомеры отличаются расположением водородных атомов и гид-роксильных групп у асимметрического атома углерода, отмеченного звездочкой, — первый лактат имеет группу ОН справа и называется D-изомером (от лат. dexter — правый), второй имеет ее слева и поэто­му назван L-изомером (от лат. laevus — левый).

L-лактат является промежуточным продуктом обмена веществ в человеческом организме и легко превращается в пировиноградную кислоту, которая окисляется до СО₂ и Н₂О в цикле трикарбоновых кислот или используется для синтеза гликогена. D-лактат, наоборот, очень медленно распадается в организме, а новорожденные его вовсе не утилизируют. Поэтому продукты для вскармливания грудных де­тей не должны содержать D-форму молочной кислоты или содержать ее мало. Следовательно, для приготовления детских кисломолочных смесей следует сочетать штаммы микроорганизмов, образующие L(+) или DL-молочную кислоту, например, бифидобактерии и ацидофиль­ную палочку (а при производстве йогурта — термофильный стрепто­кокк и болгарскую палочку).

Молочная кислота может быть не единственным конечным про­дуктом гомоферментативного молочнокислого брожения. Ход бро­жения часто изменяется в зависимости от конкретных условий (на­личия СО₂, кислорода, рН, температуры среды и т.д.). Возможные ме­таболические пути превращения глюкозы гомоферментативными мо­лочнокислыми бактериями (а также другими бактериями и дрожжа­ми) представлены на рисунке 5.1. Как видно из приведенной схемы, в качестве побочных продуктов могут образовываться летучие и неле­тучие органические кислоты, глицерин, ацетальдегид, спирты, аце­тон, ацетоин, диацетил, диоксид углерода и др.

Например, некоторые виды молочнокислых бактерий сбражива­ют часть глюкозы в этанол, уксусную и муравьиную кислоты (рисунок 5.1, путь б). Сначала глюкоза превращается в пировиноградную кис­лоту, которая затем расщепляется на ацетил-КоА и муравьиную кис­лоту (последняя может распадаться на СО₂ и Н₂). Далее половина молекул ацетил-КоА переходит в уксусную кислоту, другая половина — в этанол.

Данный путь сбраживания глюкозы характерен для таких нети­пичных молочнокислых бактерий, как кишечная палочка Е. coli. Суммарная реакция брожения глюкозы этими бактериями имеет следующий вид:

C₆H₁₂O₆+Н₂O + 3Ф_Н + 3АДФ ¾®

¾® С₂Н₅ОН + CH₃COOH + 2Н₂ + 2СО₂ + 3АТФ

Часть глюкозы может превращаться в янтарную, пропионовую, яблочную и другие органические кислоты (путь в). Могут образовы­ваться ацетон, изопропиловый и бутиловый спирты, а также масля­ная кислота (путь г).

Рисунок 5.1 - Возможные варианты превращения глюкозы по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса

(по Мецлеру, с изменениями)

Возможно также превращение глюкозы в аро­матические вещества: ацетоин, бутандиол-2, 3-диацетил (пути д и е). Однако эти вещества образуются из глюкозы лишь в небольших количествах. Более значительное их количество образуется при сбра­живании лимонной кислоты.

Гетероферментативное молочнокислое броже­ние. Бактерии группы лейконостоков и гетероферментативные молочнокислые палочки не могут сбраживать глюкозу по гликолитическому пути, для ее расщепления они используют пентозофосфатный (фосфоглюконатный, или гексозомонофосфатный шунт) путь. Это объясняется отсутствием у них ключевого фермента альдолазы, необходимого для расщепления фруктозо-1,6-дифосфата на две молекулы триозофосфата. Пентозо­фосфатный путь окисления глюкозы представлен на рисунке 5.2.

Рисунок 5.2 – Пентозофосфатный путь расщепления глюкозы

гетероферментативными молочнокислыми бактериями

Сначала происходит дегидрирование глюкозо-6-фосфата, катали­зируемое дегидрогеназой (глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназой), ко­торая в качестве акцептора водорода использует НАДФ⁺ или НАД⁺.

Затем 6-фосфоглюконовая кислота подвергается окислительному декарбоксилированию (при участии фермента 6-фосфоглюконат—дегидрогеназы) с образованием рибулозо-5-фосфата и восстановлен­ной формы НАД или НАДФ. Рибулозо-5-фосфат под действием изомеразы далее превращается в рибозо-5-фосфат. Образовавшийся пен-тозофосфат при участии фосфокетолазы расщепляется на 3-фосфоглицериновый альдегид и ацетилфосфат, которые соответственно пре­вращаются в лактат и этанол.

В ходе реакций по пентозофосфатному пути из каждого моля глю­козы образуются моль молочной кислоты, моль этанола и СО₂:

C₆H₁₂O₆ + Ф_Н + АДФ ¾® С₃Н₆О₃ + C₂H₅OH + СО₂ + АТФ

Энергетический баланс брожения глюкозы, протекающего по это­му пути, составляет одну молекулу АТФ. В аэробных условиях воз­можно образование двух молекул АТФ, тогда ацетил-фосфат превра­щается не в этанол, а в уксусную кислоту (см. рис. 5.2).

Фруктозо-6-фосфатный путь расщепления глю­козы бифидобактериями. Бифидобактерии в отличие от пентозофосфатного пути превращают глюкозу не в глюкозо-6-фосфат, а во фруктозо-6-фосфат, который далее расщепляется фосфокетолазой на эритрозо-4-фосфат и ацетилфосфат (рисунок 5.3). Затем эритрозо-4-фосфат и фруктозо-6-фосфат под действием ферментной системы перестройки Сахаров превращается в два моля пентозофосфата (ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата). Далее пентозофосфат расщепляется на ацетил-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат, который переходит в пируват.

Рисунок 5.3 – Путь сбраживания глюкоза бифидобактериями

На последней стадии пируват восстанавливается до лактата (или расщепляется до ацетата и формиата). Таким образом, образование уксусной и молочной кислот происходит в молярном отношении 3:2. Выход АТФ составляет 2¹/₂ моля на 1 моль глюкозы. Цитраты бифидобактерии не используют.

Бифидобактерии имеют низкую b-галактозидазную активность и плохо развиваются в молоке. Для стимуляции их роста целесооб­разно в закваски вводить культуры термофильного стрептококка обладающего повышенной b-галактозидазной активностью.