Регистрация опыта с лизоцимом

Пробирки	Компоненты	Результаты
Физиологический раствор	Взвесь бактерий	Яичный белок в разведении 1:25
Контроль	1 мл	1 мл	—
Опыт	—	1 мл	1 мл

Контрольные вопросы

Какие правила необходимо соблюдать при взятии и пересылке материала для бактериологического исследования?

Что такое бактериемия?

Что такое септицемия (сепсис)?

Что такое септикопиемия?

В чем заключается подготовка погибшего животного к вскрытию?

Какие условия необходимо соблюдать при вскрытии заразного трупа?

В каком порядке производится вскрытие и исследование трупов животных?

Какой материал чаще всего берется для бактериологического исследования?

Как производится взятие крови из трупа животного?

Как производится взятие материала для посевов из органов трупа животного?

Что такое иммунитет?

Какие виды иммунитета в отношении инфекционных болезней вы знаете?

Каковы анатомо-физиологические механизмы естественной резистентности?

Каковы основные направления в развитии современной иммунологии?

Какие клетки обладают фагоцитарной активностью?

Какое различие между завершенным и незавершенным фагоцитозом?

Из каких фаз состоит фагоцитарный процесс?

Кто является создателем фагоцитарной теории иммунитета?

Как фиксируются препараты-мазки для изучения фагоцитоза?

Что такое бактериотропины и опсонины?

Что такое фагоцитарное число?

Что такое опсонический индекс?

Как определяют фагоцитарное число и опсонический индекс?

Что такое лизоцим, какова его химическая природа?

Где содержится лизоцим в организме человека?

В чем проявляется действие лизоцима на бактерии?

Как ставится опыт для изучения действия лизоцима на бактерии?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 15.

Иммунитет - это способ защиты организма от живых тел и веществ, несущих на себе признаки генетически чужеродной информации.

Рис.1.Схема вскрытия животного

З А Н Я Т И Е16

Дата ______________

Тема: Антигены и антитела. Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Реакция агглютинации (РА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция преципитации (РП). Реакция связывания комплемента (РСК).

План занятия:

1. Антигены. Виды антигенов: корпускулярные, растворимые. Ток­сины, анатоксины. Приготовление антигенов.

2. Антитела. Иммунные сыворотки. Получение иммунных сывороток.

3. Реакции иммунной сыворотки. Реакция агглютинации:
а) на стекле;

б) в пробирке.

4. Антигены бактериальной клетки. "0"-,"Н"-, "К"-антигены , их свойства. Приготовление "О" и "Н"-антигенов. Реакция агглютинации на стекле с "О" и "Н"-антигенами.

5. Тканевые антигены. Эритроциты. Реакция агглютинации эритроцитов - гемагглютинация.

6. Понятие о титре агглютинирующей сыворотки. Определение титра агглютинирующей сыворотки, с "Н"-антигеном.

7. Использование классического пробирочного метода реакции
агглютинации для:

а) определения титра антител в сыворотке больного (серологический метод диагностики);

б) определения антигенного строения выделенного возбудителя (серологическая идентификация возбудителя в ходе бактериологического исследования).

8. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), или непрямой гемагглютинаций (НПГА). Варианты использования РПГА.

9. Варианты реакций агглютинации на стекле, которые используют
в качестве методов экспресс-диагностики:

а) реакция коагглютинации;

б) реакция латекс-агглютинации;

в) реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) и др.

10. Реакция преципитации. Получение бактериального гаптена и
постановка реакции кольцепреципитации.

11. Реакция преципитации в геле (агаре) для определения:

а) природы антигена;

б) природы антител.

12.Реакция лизиса. Гемагглютинация, гемолиз.

13.Реакция связывания комплекса (РСК). Методика постановки РСК. Постановка основного опыта.

Методические указания

1. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:

а) каждый студент получает одну пробирку с соответствующей культурой бактерий и проверяет её чистоту макро- и микроскопически; препарат-мазок окрасить по Граму;

б) приготовить взвесь бактерий в физиологическом растворе, стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл физиологичес­кого раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть бактерий со среды;

в) с помощью стерильной пипетки перенести взвесь бактерий в стерильную пробирку и прогреть ее для умерщвления бактерий на водяной бане при температуре 70° в течение 30 минут для вибриона и 60 минут для кишечной палочки;

г) установить концентрацию бактерий во взвеси с помощью опти­ческих стандартов, после чего приготовить необходимое разведение антигена.

2. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:

а) демонстрация различных способов иммунизации животных: подкожный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения антигенов;

б) демонстрация различных способов получения крови от иммунизированных животных: взятие крови из вен у кролика и у лошадей, взятие крови из сердца у кролика и морской свинки.

3. Реакция агглютинации:

а) ориентировочная реакция на стекле. На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;

б) реакция агглютинации в пробирке. В опыт берут две пробирки, специально используемые для реакции агглютинации. В одну из них добавляют 0,5 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:25 (опыт), а в другую - 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл соответствующего антигена, содержащего в I мл I млрд микробных тел. После перемешивания пробирки помещают в термостат на 2 часа при температуре 37⁰, после чего учитывают результат.

Реакция агглютинации на стекле: 1 – опыт; 2 – контроль

Вибрион Окраска по Граму

В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность. При более длительном хранении пробирок (24 часа) в контрольной пробирке также может образоваться осадок, однако при встряхивании пробирок он разрушается и жидкость становится равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках: 1 – опыт; 2– контроль

4. Разбор методов приготовления 0- и Н-антигенов.

Реакция агглютинации на стекле с 0- и Н-антигенами. На чистое хорошо обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят две капли сыворотки, содержащей 0- и Н-антитела. В одну аз них добавляют каплю антигена 0, в другую - каплю антигена Н. Антигены перемешивают с сыворотками (пользоваться разными петлями, или петлю прокаливать после перемешивания одной капли!). В капле, в которую был добавлен 0-антиген, образуется мелкозернистый осадок агглютинат, а в капле с Н-антигеном - крупнохлопчатый агглютинат.

5. Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пасте­ровской пипеткой каплю агглютинирующей сыворотки (полученной при иммунизации кроликов бараньими эритроцитами), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по одной капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки!). С помощью бактериальной петли перемеши­вают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при покачивании стекла и осторожном подогревании.

В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит, так как там отсутствуют антитела.

Реакция агглютинации: 1 – О-агглютинация. 2 – Н-агглютинация.

Гемагглютинация: 1- Опыт. 2- Контроль.

6. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:

а) агглютинирующую сыворотку против водного вибриона в исход­ном разведении 1:25;

б) взвесь убитых вибрионов (диагностикум: содержащий в I мл I млрд микробных тел);

в) физиологический раствор;

г) две пипетки емкостью I мл и 5 мл ;

д) штатив с набором из 8 агглютинационных пробирок.

Порядок работы

1) пронумеровать все пробирки;

2) разлить по 0,5 мл физиологического раствора во все пробирки, за исключением первой;

3) налить в первую и во вторую пробирки по 0,5 мл сыворотки в разведении 1:25;

4) перемешать сыворотку с физиологическим раствором во второй пробирке и перенести пипеткой (емкостью I мл) 0,5 мл в третью про бирку, после перемешивания 0,5 мл разведенной сыворотки переносится таким же образом из третьей пробирки в четвертую, из четвертой в пятую и т.д. до седьмой пробирки, из седьмой пробирки 0,5 мл жидкости удаляется. В восьмой пробирке сыворотки не должно быть. Она служит контролем антигена. После такого разведения сыворотки во все пробирки, но уже другой пипеткой, добавляют антиген по 0,5 мл. Пробирки энергично встряхивают вместе со штативом (для перемешивания антигена с антителом) и помещают в термостат при 37⁰ на 2 часа, после чего читают предварительный результат. Окончательный результат опыта регистрируют через 24 часа.