Антибиотики. определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Оборудование и материалы. Стерильные чашки Петри с МПА, пробирки с чистой культурой стафилококка и кишечной палоч­ки, стерильные градуированные «концевые» пипетки на 2 мл, ре­зиновые груши, набор стандартных дисков с разными антибио­тиками, стерильные пинцеты, линейки.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорга­низмы или подавлять их рост. Абсолютное большинство извест­ных антибиотиков получают из актиномицетов. Бактерии синте­зируют такие антибиотики, как полимиксины, грамицидины, бацитрацин, гризин. Из грибов выделены пенициллины, цефалоспорины, фумагиллин, гризеофульвин, из животных тка­ней — эритрин, экмолин, из высших растений — аллицин и др. Часть антибиотиков получают химическим синтезом (левомицетин), а большинство — биосинтезом. Активность препаратов оп­ределяют бактериологическими или физико-химическими мето­дами. Биологическую активность антибиотиков выражают в ус­ловных единицах действия — ЕД. За 1 ЕД принимают специфи­ческую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата, но для бензил пенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в мкг активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата.

Успех лечения инфекционных заболеваний человека и живот­ных зависит от выбора эффективного лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя болезни. Материал для лабораторного исследования следует брать до лечения антимикробными препаратами. Чувствительность микроорганизма к антибиотикам определяют с чистой культурой возбудителя.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к анти­биотикам. К ним относят метод диффузии в агар, метод серий­ных разведений (на жидкой и плотной питательных средах) и ускоренные методы.

Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков). Это наибо­лее простой в исполнении метод. В качестве питательной среды применяют МПА, агар на переваре Хоттингера с содержанием 120...140мг% аминного азота (рН 7,2...7,4) или агар фирмы «Дифко». Диски с антибиотиками (диаметр 5...6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск со­держит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпают силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении ме­няет окраску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для использования непригодны. Флако­ны с дисками хранят при температуре 4...20 "С.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4...5 мм). Перед посевом чашки со сре­дой досушивают в термостате. Для посева используют суточную бульонную культуру или смывы суточной агаровой культуры. 1 мл микробной суспензии в физиологическом растворе (кон­центрация клеток 10⁹/мл) наносят на агар и покачиванием чаш­ки распределяют по поверхности питательной среды. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Засеян­ные чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30...40 мин, а затем на поверхность среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиоти­ками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37 °С 18 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким образом вокруг диска зону отсутствия роста (рис. 49). Ближе к диску концентрация ан­тибиотика в агаре выше, по мере удаления от диска концентра­ция снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задер­жки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точ­ностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки роста микроорганиз­мов вокруг диска указывает на устойчивость исследуемой культу­ры к данному антибиотику. При зоне задержки роста до 14 мм говорят о малой чувствительности к антибиотику, от 15 до 25 мм — о достаточной чувствительности, свыше 25 мм — о высо­кой чувствительности.

а — к пенициллину; б— к стрептомицину; в — к неомицину; /—зона задер­жки роста (стерильная зона); 2 — сплошной рост бактерий на поверхности питательной среды; 3 — бумажный диск с антибиотиком

Чтобы получить более точные результаты исследования, необхо­димо соблюдать стандартные условия при постановке опыта. Для проверки точности и стандартности определения чувствительности к антибиотикам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) реко­мендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорга­низмов, которыми служат три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, №СТС 6571), E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662).

Метод серийных разведений. Для проведения опыта готовят ос­новные растворы антибиотиков, используя стандарты антибио­тиков. На этикетке ампулы со стандартом указана концентрация антибиотика в ЕД/мл или мкг/мл. Навески бензил пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина тригидрата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15M фосфатном буфере. Основные растворы тетрациклиновых антибиотиков готовят на 0,01 н. растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина ис­пользуют дистиллированную воду. Концентрация основных ра­створов антибиотиков 1000 мкг/мл.

Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: при определении чувствительности к антибиотикам для основной массы микроорганизмов использу­ют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для стрептококков в среду добавляют 1 % глюкозы, для патогенных грибов исполь­зуют среду Сабуро.

Агаровые или бульонные культуры микроорганизмов предва­рительно разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5 • 10⁶/мл.

Схема опыта приведена в таблице 2.

Учет результатов: наименьшее количество антибиотика, даю­щее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), со­ответствует минимальной подавляющей концентрации препара­та (МПК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют высевом на плотные питательные среды из последних прозрачных пробирок, которые предварительно встряхивают. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24...72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принима­ют за МБцК.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде: для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или агар на переваре Хоттингера с содержанием аминного азота 120...140мг/мл, рН 7,2...7,4. Приготовленный основной ра­створ антибиотиков разводят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлажденному до 55 ºС агару, разлито­му в широкие пробирки по 18 мл, добавляют по 2 мл соответству­ющего разведения определенного антибиотика, тщательно пере­мешивают и переливают в стерильную чашку Петри. После зас­тывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Конт­рольные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засевают ис­следуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 10⁶...10⁷/мл. Чашки помещают в термостат при 37 ºС на 20...24 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при которой на­блюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост еди­ничных колоний, принимают за МПК препарата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме конт­рольной, считают, что исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК препарата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем кон­центрациям антибиотика.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Определить чувствительность культуры стафилококка к анти­биотикам методом бумажных дисков.

Контрольные вопросы

1.Что такое антибиотики?

2.Как используют антибиотики в ветеринарии?

3.Какими методами определяют чувствительность микроорганизмов к анти­биотикам?

4.Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?

Тема 12