Исследование молекулярной массы и формы макромолекул

Практическая работа

На тему: «Эксперементальные методы в биофизике»

Практическая работа № 2

СЕДИМЕНТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ

Исследование молекулярной массы и формы макромолекул

Выполнил: Горлищев Василий

Факультет: Кибернетика

Группа: КББ-1-11

Вопрос №1: Что такое седиментация? Существует ли противоречие между существованием данного метода и принципом Галилея о независимости ускорения свободного падения от массы тела ?

Седиментация-это осаждение частиц в жидкости под действием силы тяжести.

Да,существуют,т.к. процесс седиментации подразумевает ускорение осаждения осадка,а классический принцип Галилея это отвергает.

Вопрос №2: Назовите основные трудности при применении метода седиментации к макромолекулам и способы преодоления этих затруднений?

Трудности при пременениии метода седиментации к макромулекулам и способы решения :

Для макромолекул сила гравитации настолько мала, что действие случайных соударений с молекулами растворителя значительно превышает седиментацию макромолекул.

Возникшее затруднение можно преодолеть, увеличив потенциальную энергию до величин, превышающих k T. Это можно сделать в ультрацентрифуге.

Вопрос №3: Какие устройства используются для реализации метода седиментации и каковы их основные характеристики ?

Центрифуга,для частиц размерами меньше 1мкм. В проведенных экспериментах центробежная сила в раскрученной центрифуге превышает силу гравитации примерно 50 раз при скорости вращения 750 об/мин и радиусе центрифуги равной 8см.

Вопрос №4: Как определяется скорость седиментации ?

, где - длина капилляра, - концентрация частиц рассматриваемойфракции, - момент времени взятия пробы.

Вопрос №5: Каков принцип метода скорости седиментации ?

Основным принципом является поиск константы седиментации:

S⁰_20,w = s (h /h_20,w ) × (1- r₀ W )_20,w / (1- r₀ W ).

Плотность - r₀ ; Вязкость - h:

Парциальный объем находят по формуле:

W = 1/r – (1/c) × ((r -r₀ ) /r ),где r₀ = m₀ /V , p = m/V

Вопрос №6: Опишите силы действующие на макромолекулу в процессе седиментации. Почему молекулы седиментируют равномерно ?

Молекулы седементируют равномерно,так как действующие на них силы уравновешены,этими силами являются :

F =Fв +Fс

Центробежная сила:

F = mw²x = 4/3×pr³rw² x,

где m- масса макромолекулы; r- радиус макромолекулы; p- плотность макромолекулы; x - расстояние от оси вращения ротора.

Угловая скорость:

w = pn/30 [c^-1],

где n – скорость вращения ротора, об/мин.

Выталкивающая сила:

Fв = m₀ w² x = 4/3×pr³r₀ w² x,

Сила сопротивления:

Fc = f v,

где f - коэффициент внутреннего трения.

Вопрос №7: Как определяется молекулярная масса макромолекул. Какие величины необходимо измерить в эксперименте для её определения ?

Молекулярная масса макромолекулы запишется как:

M = RTs / D (1- r₀ W )

R – const,T – температура, D – коэффицент диффузии, pо -плотность растворителя, парциальный удельный объем - W = 1/r .

Вопрос №8: Что такое скорость седиментации, коэффициет седиментации и парциальный удельный объем и почему его необходимо измерять с высокой точностью?

Коэффициент седиментации s - отношение скорости седиментации v к угловому ускорению w²x:

s = v/w²x = dx/dt × 1/w² x = 1/w ² × d(ln x)/dt.

Размерность коэффициента седиментации – [с].

Скорость седиментации – зависимость положения ширины пика от времени:

v = dx/dt.

Парциальный удельный объем:W = 1/r [ л/кг ].

Он определяется как возрастание объема растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объеме растворителя. Требуется высокая точность измерения , так как для биологических макромолекул он изменяется в небольших пределах (от 0,6 до 0,75). Ошибка при его измерении в 1% дает ошибку в определении до 3% .

Вопрос №9: Как измеряется плотность раствора и константа седиментации ?

Плотность раствора измеряется пикнометрическим способом (взвешивание фиксированных V объемов растворителя и раствора). В пикнометр заливаются одинаковые объемы растворителя и раствора макромолекул с известной концентрацией с. Затем эти пробирки точно взвешиваются и определяются плотности растворителя и раствора p = m/V.

Константу седиментации S⁰_20,w определяют так:

S⁰_20,w = s (h /h_20,w ) × (1- r₀ W )_20,w / (1- r₀ W)

Вопрос №10: Какова качественная зависимость скорости седиментации и коэффициента диффузии от массы макромолекулы?

Скорость седиментации не зависит от массы молекулы.

Коэффициент диффузии имеет обратно пропорциональную зависимость от массы.

Вопрос №11: Что общего между процессом осветления полидисперсной суспензии и седиментацией ?

Оба ведут к отделению твердой фракции от жидкой, под действием массовых сил.

Вопрос №12: Какая методика используется в эксперименте, описанном в данной практической работе ? Какая проблема возникает при исследовании скорости седиментации мкм-диапазоне размеров частиц и как она решается?

Применяется методика, которая основана на взятии проб седиментирующейся суспензии в выбранной точке используемого аппарата (тарельчатой центрифуге) в определенные моменты времени. Для определения скоростей частиц в полидисперсной суспензии достаточно измерить во взятых пробах распределение частиц по размерам и общую концентрацию твердой фазы.

Проблема, с которой приходиться сталкиваться при экспериментальном определении скорости седиментации, это очень медленное движение частиц в микрометровом диапазоне их размеров. Решение этой проблемы заключается в том, что частицы в центрифуге движутся к внешней стенке под действием центробежной силы, превышающей силу гравитации в десятки раз. Суспензия в целом при этом остается неподвижной. Применяя центрифугу можно проводить эксперименты с частицами размером меньше 1 мкм.

Вопрос №13: Как готовится суспензия для экспериментов ? Опишите особенности конструкции центрифуги. Как исследуется распределение частиц в приборах фирмы Malvern ?

Приготовление суспензии заключается в отмере точных объемов жидкости (вода из под крана, рН=7,2) и твердого вещества (песок, с содержанием силиция 99% и плотностью р=2600 кг/м), так чтобы установить желаемую концентрацию суспензии.

После окончания процесса приготовления суспензии берется проба, у которой определяется исходная функция распределения диспергированных частиц по размерам. Далее суспензия как можно быстрее заливается в уже раскрученную центрифугу (рис.3), и сразу после того как заполнится весь объем, начинается отсчет времени и взятие проб через капилляры. В ходе эксперимента берется от 5 до 10 проб объемом 2 мл. Такого объема пробы достаточно для исследования суспензии на общую концентрацию твердой фазы и распределения частиц по размерам.

Экспериментальными данными, на основании которых делаются большинство выводов о поведении частиц при седиментации, являются измеренные распределения частиц (в том числе и биологических макромолекул) по размерам во всех пробах. Для получения этих значении используется прибор Маstersinzег 2000 фирмы Маlvern, принцип действия которого основан на измерении распределения интенсивности рассеянного лазерного луча,пропущенного через суспензию.

Вопрос №14: Опишите (качественно) результаты эксперимента и основные выводы, вытекающие из этих результатов ?