Методические указания подготовил

КАФЕДРА ФИЗИКИ

ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛЯРИМЕТРА

Методическиеуказания для лабораторной работы № 13

(для фармацевтического факультета)

Тверь 2008

Методические указания составлены кафедрой медбиофизики ТГМА и предназначены в помощь студентам фармацевтического факультета при подготовке и выполнении лабораторной работы.

Методические указания подготовил

Туровцев В.В.

Лабораторная работа № 13

ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛЯРИМЕТРА

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

1. Изучить явление поляризации света и его применение для исследования оптически активных веществ.

2. Освоить метод определения концентрации растворов оптически активных веществ с помощью поляриметра.

3. Определить концентрацию оптически активного вещества.

ПРИБОРЫ И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ: поляриметр, кюветы с растворами оптически активных веществ, осветитель.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика. М.: Высшая школа, 1999. (см. Глава 25).

2. Ремизов А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. Медицинская и биологическая физика. М.: Дрофа, 2003. (см. Глава 20).

3. Лекции по теории вероятности и математической статистики (II семестр).

4. Морозов Ю.В., Основы высшей математики и статистики. М.: Медицина, 1998. (см. п. 9.4).

5. Павлушков И.В. и др., Основы высшей математики и математической статистики. М.: Геотар-Мед., 2003. (см. п. 8.2.2, 8.2.3).

КРАТКАЯ ТЕОРИЯ

Свет - это электромагнитные волны с длиной волны от 380 нм до 760 нм. В электромагнитных волнах направления вектора напряженности электрического поля , вектора индукции магнитного поля и вектора скорости распространения волны расположены перпендикулярно друг другу. Химическое и биологическое действие света связано с электрической составляющей электромагнитной волны и её действием на заряженные частицы. Сила, действующая со стороны электрического поля на электрический заряд и вызывающая его смещение, пропорциональна и сонаправлена с вектором напряжённости.

Распространение света можно рассматривать, как электромагнитное поле, распространяющееся в пустом пространстве или возмущение, распространяющееся в электромагнитном поле, так и в виде взаимодействия множества элементарных атомных излучателей (осцилляторов). Каждый осциллятор, получив квант энергии, переходит в возбужденное состояние. Спустя очень короткий отрезок времени он возвращается в основное состояние с излучением энергии в виде электромагнитной волны. Электромагнитные волны от множества осцилляторов представляет собой совокупность случайных обрывков (цугов), и, следовательно, общая волна содержит набор беспорядочно ориентированных направлений вектора , лежащих в плоскостях, проходящих через направление светового луча. Такой луч света называется естественным (неполяризованным). Луч света, в котором все вектора лежат в одной плоскости, называется плоскополяризованным. Плоскость, проведенная через вектор и направление распространения , называется плоскостью колебаний поляризованной волны или плоскостью поляризации (рис. 1).

Существуют тела (поляризаторы), после прохождения которых естественный луч света становится поляризованным. Механизм поляризации естественного света поляризатором можно представить следующим образом (рис. 2). Каждый вектор напряженности в естественном луче можно представить по правилу параллелограмма как сумму двух взаимно перпендикулярных составляющих и . Составляющая , совпадающая с плоскостью поляризации поляризатора (главной плоскостью кристалла), им пропускается, перпендикулярная составляющая поглощается. Плоскостью поляризации поляризатора называется плоскость, в которой поглощение вектора напряженности наименьшее. Таким образом, после прохождения поляризатора интенсивность естественного света уменьшается в два раза.

Рис. 1

Расположение векторов , и и плоскости поляризации

Рис. 2

Расположение векторов , и

Явление поляризации также происходит при двойном лучепреломлении света, и обусловлено особенностями распространения электромагнитных волн в анизотропных средах. Оно состоит в том, что световой луч, преломляясь на границе некоторых естественных кристаллов (исландский шпат, турмалин и др.), разделяется на два различных по скорости распространения, но одинаковых по интенсивности луча: обыкновенный и необыкновенный. Оба луча поляризованы во взаимно перпендикулярных плоскостях. У таких лучей относительные показатели преломления разные, и, иногда говорят, что для обыкновенного законы преломления выполняются, а для необыкновенного не выполняются. Принцип действия поляризаторов основан на устранении одного из лучей, например, в призме Николя (николь).

Плоскополяризованный свет можно получить с помощью поляроидных пленок из герапатита (мелких кристаллов, закрепленных на целлулоидной пленке). Герапатит и подобные кристаллы обладают свойством дихроизма: наряду с двойным лучепреломлением они способны поглощать один из лучей значительно сильнее. Поляризация света имеет место при отражении и преломлении света прозрачными изотропными средами, при двойном преломлении света в естественных кристаллах и искусственных пленках (поляроидах), при прохождении света через мутные среды и пр.

Человеческий глаз реагирует только на интенсивность электромагнитного излучения и не может различить поляризован ли луч или нет. Если естественный свет падает на поляризатор и далее на экран (или глаз), то, вращая поляризатор, мы не заметим никакого изменения интенсивности света на экране (глазом). Наблюдаемая картина изменится, если между поляризатором и экраном поместить еще один поляризатор, называемый анализатором. При вращении анализатора в плоскости, перпендикулярной направлению луча, интенсивность светового пятна на экране изменяется от нуля до максимума. Таким образом, для определения ориентации плоскости поляризации электромагнитного излучения, требуется два поляроида (поляризатор и анализатор).

Закон изменения интенсивности поляризованного света, прошедшего анализатор, в зависимости от взаимной ориентации плоскостей поляризации поляризатора и анализатора называется законом Малюса:

. (1)

Здесь I – интенсивность света, прошедшего через анализатор [Вт/м 2]; I0 – интенсивность света, прошедшего через поляризатор и упавшего на анализатор [Вт/м 2]; φ – угол между плоскостями поляризации поляризатора и анализатора.

Поляризованный свет применяется при исследовании оптически анизотропных элементов различных структур, в частности, тканей организма. Во многих случаях при этом возможно установить расположение и строение их элементов, которые не выявляются при микроскопировании в естественном свете. Оптическая анизотропия наблюдается у мышечных, соединительно-тканных и нервных волокон, а также у мицелл в мякотной оболочке нейрофибрилл. В микроскопии биологических объектов для этих целей применяется поляризационный микроскоп.

В природе существуют вещества, способные поворачивать плоскость поляризации плоскополяризованного света, которые называются оптически активными. Таким свойством обладает кварц, а также некристаллические вещества: скипидар, раствор сахара в воде, пары камфары. Для растворов этих веществ установлен закон зависимости угла поворота плоскости поляризованного света от концентрации оптически активного вещества, лежащий в основе поляриметрии:

, (2)

где C - концентрация оптически активного вещества, l - толщина слоя раствора, [a₀]- коэффициент пропорциональности (удельное вращение), имеющий смысл угла поворота плоскости поляризации плоскополяризованного света при прохождении столба жидкости единичной концентрации и единичной длины. Величиной удельного вращения называют увеличенный в 100 раз угол вращения для столба раствора длиной 1 дм при концентрации вещества 1 г на 100 мл раствора при температуре 20 ^оС и длине волны света λ = 589 нм. Его величина приблизительно обратно пропорциональна квадрату длины волны света и зависит от температуры и свойств растворенного вещества.

Метод поляриметрии основан на зависимости угла поворота плоскости поляризации от концентрации оптически активного вещества. Он широко используется в медицине и биологии, в клинической практике (например, для определения оптической активности сывороточных белков с целью диагностики рака, для количественного определения содержания сахара в моче – сахариметрия и т.д.).

Используя различные светофильтры, можно определить величину удельного вращения и найти зависимость удельного вращения от длины волны (дисперсию оптической активности). Поляриметрию применяют также как метод исследования структурных превращений, в частности в молекулярной биофизике, т.к. при изменении конформации большинства биологически активных молекул (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.п.) изменяется удельное вращение. Т.е. по величине удельного вращения можно определить равновесную конформацию вещества в данных условиях.

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ПОЛЯРИМЕТРА

а б

Рис. 3

а- внешний вид поляриметра, б - устройство поляриметра (назначение частей, отмеченных цифрами см. в тексте)

Рис. 4

а б в

а, в –поляриметр не настроен, б – положение, при котором производят отсчет угла поворота.

Основными частями поляриметра являются поляризатор и анализатор. Поляриметр (рис. 3) состоит из трубки, в которой находятся все оптические детали, и опорной стойки. В трубке находится углубление, куда вставляется кювета. Кювета поляриметра имеет длину 0,95 дм. Световой поток, отразившись от зеркала 1, проходит через оранжевый светофильтр 2, поляризатор 3, кварцевую пластинку4, которая разделяет его на две части, и кювету 5. При вращении анализатора 6 половина поля зрения (рис. 4) освещается, а другая затемняется. Поле зрения рассматривают через окуляр 7 и через лупу шкалу 8. Оранжевый светофильтр пропускает монохроматический свет с длинной волны 589 нм.

Измерительное устройство анализатора имеет основную шкалу (верхнюю) и нониус (нижняя шкала) для определения угла поворота плоскости поляризации правовращающих («положительных») и левовращающих («отрицательных») веществ (рис. 5). По верхней (основной) шкале находят число целых градусов, по нониусу десятые доли. Угловое положение анализатора относительно поляризатора a определяется с точностью до 0,1°. Данная величина принимается за систематическую приборную погрешность (Da_пр = 0,1°).

Процесс измерения состоит из трех этапов. Вначале, вращая анализатор, нужно получить такое положение, при котором всё поле зрения затемняется равномерно (одноцветно), и линия раздела полей исчезает (рис. 4 б). На втором этапе находят количество полных градусов. Для этого смотрят на сколько нулевой штрих нониуса (рис. 5 а) сдвинут относительно основной шкалы вправо или влево, т.е. после какого штриха основной шкалы стоит нулевое деление нониуса. На последнем этапе замечают, какой по счёту штрих нониуса совпадает со штрихом основной шкалы (два штриха должны составлять единую линию). Для левовращающих веществ используется шкала нониуса, находящаяся слева от нуля нижней шкалы, для правовращающих – справа. Совпадающий штрих нониуса показывает десятые доли градуса, которые нужно прибавить к ранее найденному числу целых градусов. Если точно совпадают нулевое значение или последний штрих нониуса, то число десятых градусов равно нулю. Например, нулевой штрих нониуса лежит между 2° и 3° правой шкалы, и восьмой штрих нониуса совпадает со штрихом основной шкалы. Следовательно, угол поворота равен +2,8°.

а б

Рис. 5

а) угол поворота плоскости поляризации равен 2,8°; б) угол поворота плоскости поляризации равен +4,2°

Отсчёт по шкале анализатора без кюветы с раствором должен приводить к совпадению нулевых делений нониуса и шкалы (положение нуля). Однако со временем положение нуля может отличаться от истинного значения – появляется систематическая ошибка (сдвиг нуля Da_0,пр). Поэтому, при расчётах требуется вносить поправки на сдвиг нуля. Предположим, что нулевая точка получилась в положении анализатора Da_0,пр = +0,2° (знак «+» означает справа) и, если при последующем измерении c наполненной кюветой получили одинаковую освещенность в положении анализатора +2,1°, то искомый угол вращения равен + 2,1°- 0,2°= +1,9°; если же нулевая точка будет -0,2° (влево), то искомый угол поворота равен +2,1°- (-0,2°) = 2,1°+ 0.2°= 2,3° и т.д.

Концентрация неизвестного раствора (С), исходя из (1), определяются по формуле:

C = . (3)

Для её расчета необходимо знать величину удельного вращения, которую требуется предварительно рассчитать, измеряя угол поворота плоскости поляризации в растворе с известной концентрацией.

, (4)

Однако любое прямое или косвенное измерение неизбежно содержит ошибку измерения, влияющие на итоговую величину. Для учета случайных погрешностей можно использовать следующую процедуру.

График зависимости концентрации от угла поворота С = f(a) представляет собой прямую, проходящей через начало координат, т.е. С = ka, где

. (5)

Величину k можно вычислить методом наименьших квадратов по экспериментальной зависимости С = f(a), зная угол поворота a для вещества с известной концентрацией. Для этого возьмем два вещества с концентрациями С₁ и С₂. Измерим n раз углы поворота a₁ при С₁ и a₂ при С₂. Вычислим средние значения и согласно (6)

, (6)

т.к. график функции проходит через точку (0;0), то таблица будет выглядеть следующим образом

Таблица 1.

С		С1	С2

По стандартным соотношениям теории погрешностей методом наименьшим квадратов вычислим значение k.

. (7)

Учитывая, что линия регрессии проходит через начало координат, выражение (7) упрощается до

. (8)

Удельное вращение находится по выражению (9).

. (9)

Теперь, зная k, легко вычислить концентрацию неизвестного вещества (10), достаточно определить угол поворота плоскости поляризации неизвестного раствора .

(10)

УЧЕТ ПОГРЕШНОСТЕЙ ИЗМЕРЕНИЙ (ЭЛЕМЕНТЫ ТЕОРИИ ОШИБОК)

Определение физических величин подразделяется на прямые и косвенные измерения. Прямые измерения осуществляются посредством измерительных приборов, при косвенных измерениях искомую величину получают с помощью формул, таблиц, графиков, номограмм. Не существует физических величин, имеющих абсолютно точные числовые значения. Всегда имеется некоторая неопределённость в значении искомой величины. Эта неопределённость характеризуется погрешностью (ошибкой) – отклонением измеренного значения величины от её истинного значения.

Все погрешности можно разделить на: случайные и систематические. Случайные погрешности физического эксперимента, обычно, распределены по нормальному закону с нулевым математическим ожиданием. Математическое ожидание систематической ошибки не равно нулю. Различные погрешности имеют место и в процедуре измерения физических величин. Не существует измерений, не вносящих какую-либо погрешность в измеряемую величину. По причине возникновения погрешности делятся на: методические, инструментальные, статистические и т.д. Методические или теоретические погрешности обусловлены границами применимости используемой теории – неполным соответствием измеряемого объекта той модели, которая принята для измеряемой величины. Например, применения законов Ньютона к телам, движущимся со скоростями, близкими к световой. Статистические погрешности возникают из неполноты сведений о виде распределения, исследуемом объекте, не репрезентативности или малого объема выборки. Погрешности, вносимые используемыми измерительными приборами, называются инструментальными.

Погрешности прямых измерений, в свою очередь, так же делятся на систематические, случайные и промахи. Промахи есть грубые ошибки, при которых измеренное значение резко отличается от остальных измерений. Промахи, обычно, вызваны невнимательностью экспериментатора, неисправностью прибора или неправильным использованием прибора. Промахи можно исключить из выборки, только зная вид распределения и границы применимости теории.

Для всех систематических ошибок характерно постоянное отклонение измеряемой величины от её истинного значения всегда в одну сторону. В одних и тех же условиях и при использовании одного и того же метода, величина этой погрешности остается неизменной. Систематические ошибки исключаются из выборки, сравнивая показания используемого при измерении прибора с эталонным, или проводя измерения над эталонными объектами. Найдя ошибку, и вычтя её от показания прибора, мы можем скорректировать найденное численное значение измеренной величины. Приборные погрешности (Dх_пр) – вид систематических ошибок, связанных с точностью изготовленного прибора, используемого для измерений. Они обусловлены конструкцией измерительных приборов и технологией их изготовления. Погрешности измерительных приборов, обычно, характеризуется классом точности прибора. Величину ошибки принимают равной половине цены деления шкалы для стрелочных приборов, для приборов с дискретным отсчетом (цифровым отображением), приборов, имеющих нониусы, и приборов со значениями регулируемой величины, указываемой у рукояток переключателей, приборная ошибка считается равной минимальному шагу шкалы.

Случайные ошибки (Dх_сл) возникают в результате действия огромного количества случайных факторов, учесть которые не представляется возможным. Эти ошибки имеют различные значения в отдельных измерениях, проводимых при одинаковых условиях, и подчиняются случайным, вероятностным законам. Если ни один из факторов не превалирует над другими, то вступает в действие центральная предельная теорема. В этом случае ошибка распределена по нормальному (гауссову) закону с нулевым математическим ожиданием. Случайные ошибки обрабатываются методами математической статистики. В данной работе случайная ошибка прямого измерения угла поворота Da_сл определяется по выражению

. (11)

g - доверительная вероятность, обычно принимаемая равной 0,95, для пяти измерений коэффициент Стьюдента t_g,n-1 равен 2, 776. Полная случайная ошибка прямого измерения равна

. (12)

Для определения случайной ошибки косвенного измерения величины y = f(x₁,x₂, … , x_n) используется выражение

. (13)

Абсолютную ошибку Dk в выражении (8) находят следующим образом

(14)

Величина DС_неиз, связанная с выражением (10), определяется по

, (15)

а погрешность удельного вращения

. (16)

МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ:

- внешним осмотром убедиться в исправности аппаратуры и принадлежностей, целостности первичных и вторичных проводов монтажа осветителей.

- жидкости находятся в кюветах, заполнение их проводит лаборант, КРЫШКИ НА КЮВЕТЕ НЕ ОТКРЫВАТЬ! Если под стеклом обнаружится пузырек воздуха, измерения не производить.

- учесть, что опасным фактором при выполнении работы является переменное напряжение 220 В, 50 Гц, питающее осветители;

- во время работы при появлении необычных звуков, запахов, дыма и т.п. немедленно обесточить осветители и доложить преподавателю;

- ЗАПРЕЩАЕТСЯ самостоятельно производить ремонт приборов, делать переключения и подключения, не предусмотренные заданием;

- КАТЕГОРИЧЕСКИ ЗАПРЕЩАЕТСЯ повторное включение без обнаружения и устранения причин неисправности;

- после окончания работы выключить осветители, обесточить щиток и сдать рабочее место преподавателю.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Привести поляриметр в рабочее состояние. Вращением окуляра (7) (рис. 3) получить резкое изображение линий раздела поля зрения (рис 4 а и 4 в). Вращением лупы (8) (рис. 3) получить резкое изображение градусной шкалы.

2. .Провести измерения угла поворота плоскости поляризации без кюветы 5 раз (a_0,пр). Каждый раз, смещая анализатор до упора вправо и далее поворотом анализатора (6) находя нужное положение (рис. 4 б).

3. Рассчитайте систематическую ошибку сдвига нуля .

4. Произвести измерение углов поворота плоскости поляризации известных жидкостей (a₁, a₂), проводя по пять измерений для каждой кюветы.

5. Рассчитать среднее значение угла поворота плоскости поляризации . И внести поправку на систематическую ошибку в проведенных измерениях .

6. Найти абсолютную ошибку прямых измерений (см. выражение 11).

7. Рассчитать полную ошибку прямого измерения .

8. Методом наименьших квадратов рассчитать коэффициент линейной регрессии k (выражение 8) и его погрешность Dk (выражение 14), приняв DС₁ = DС₂ = 10 мг/мл.

9. Рассчитать удельное вращение для раствора сахара [a₀] (выражение 9). Рассчитайте его абсолютную ошибку D[a₀] (выражение 16), взяв Dl = 0,1 дм.

10. Провести измерение угла поворота плоскости поляризации неизвестного раствора a_неиз пять раз. Рассчитать среднее значение угла поворота плоскости поляризации неизвестного раствора .

11. Внесите поправку на систематическую ошибку и рассчитайте полную ошибку .

12. Используя полученное уравнение линейной регрессии, рассчитать неизвестную концентрацию раствора сахара С_неиз и её погрешность DС_неиз.

13. Запишите все рассчитанные величины.

14. Запишите температуру опыта.

15. Сделайте вывод и запишите ответ в виде , , , , , . Где , , , и определены по указанным выше соотношениям.

Таблица 2.

№	Без кюветы a0,пр	, 50 мг/мл	, 150 мг/мл
…
Среднее значение

ЗАДАЧИ

1. Определить угол поворота плоскости колебаний светового луча для мочи больного диабетом при концентрации сахара С = 0,05 г/см³ . Длина трубки l = 20 см, удельное вращение сахара для используемого света [a₀] = 6,67 град×см ²/г.

Ответ: a = 6,67°.

2. Угол между главным плоскостями поляризатора и анализатора равен 60°. Во сколько раз интенсивность естественного света, падающего на поляризатор, больше интенсивности плоскополяризованного света, вышедшего из анализатора? Поглощением света пренебречь.

Ответ: в 8 раз.

3. При измерении угла поворота плоскости поляризации волны для вещества с концентрацией 50 мг/мл было получено значение 2,2°, для того же вещества с концентрацией 150 мг/мл - 6,6°. Определить концентрацию этого вeщecтвa в растворе, для которого был найден угол поворота 4,4°, при одинаковой длине столба жидкости.

Ответ: 100 мг/мл

4. При измерении угла поворота плоскости поляризации волны для раствора вещества с концентрацией 10 мг/мл было получено значение 1,2°. Определить удельное вращение раствора и показания прибора для вещества с концентрацией 40 мг/мл. Длина кюветы 2 дм.

Ответ: a = 4,8°, [a₀] = 6 град×см ²/г.

5. Интенсивность излучения, падающего на анализатор, равна 0,05 Вт/см². Найти интенсивность излучения, вышедшего из анализатора, если угол между осью анализатора и вектором напряженности падающей электромагнитной волны равен 60°.

Ответ: 0,0125Вт/см²

6. Во сколько раз изменится удельное вращение раствора сахара в воде, если длина волны проходящего через него излучения возрастает в 3 раза.

Ответ: удельное вращение уменьшится в 9 раз.

Контрольные вопросы

1. Что такое свет? В чем состоят различия естественного и поляризованного света? Что называется плоскостью поляризации поляризованной волны?

2. В чем заключается явление двойного лучепреломления? Что такое дихроизм?

3. Что такое поляризатор? Каково назначение анализатора? Может ли анализатор использоваться для поляризации света? Поясните. В чем смысл закона Малюса?

4. Что такое оптически активное вещество? Примеры таких веществ. От чего зависит угол вращения плоскости поляризации света при прохождении через оптически активное вещество?

5. В чем состоит физический смысл удельного вращения? Как зависит величина удельного вращения от длины волны света?

6. Что такое поляриметрия? Почему в сахариметре имеется две шкалы (левая и правая)? Каковы преимущества метода поляриметрии определения концентрации? С какой целью применяются поляриметры в медицине?

7. Что называется погрешностью, методической погрешностью, статистической погрешностью, инструментальной погрешностью?

8. Что такое систематическая ошибка, случайная ошибка, промах?

9. Как вносятся поправки на сдвиг нуля и приборную погрешность?

10. Какие измерения называются прямыми, какие косвенными? Как найти абсолютную погрешность?

11. Что такое регрессия, линейная регрессия? Как найти выражение для линейной регрессии?

12. Как производится отсчет угла поворота плоскости поляризации с помощью поляриметра?

13. Расскажите устройство и принцип действия поляриметра?

14. Расскажите процедуру измерений физических величин в данной работе.

15. Расскажите процедуру определения неизвестной концентрации оптически активного вещества.