Процессы биотехнологического производства

Конспект лекционных занятий (прошлогодние лекции)

Лекция №1.

Введение в дисциплину. Процессы и аппараты биотехнологического производства: предмет изучения, направления. История развития. Задачи биотехнологических процессов. Биосистемы. Биообъект, его подготовка и культивирование. Субстраты для культивирования биообъекта.

Биотехнологические процессы широко используются в различных отраслях народного хозяйства. Успехи биологических и инженерных наук позволяют создать высокопроизводительные, основанные на промышленных методах управляемые процессы биотехнологического производства ряда пищевых и кормовых продуктов, медикаментов, органических веществ.

В биотехнологии применяются многие методы химической технологии, особенно на конечных этапах, производственного процесса, при выделении веществ из культуральной жидкости или из биомассы микроорганизмов. Чтобы получить какое-либо вещество микробиологическим путем, необходима соответствующая культура микроорганизмов. Надо знать физиологию этой культуры, т.е. комплекс процессов, протекающих в клетке, и условий определяющие их протекание в желательном направлении. В состав клеток микроорганизмов входят белки, ферменты, аминокислоты, витамины, липиды и другие органические вещества, которые можно выделить из биомассы клеток, применяя методы химической технологии.

Провести микробиологический синтез на практике означает культивировать избранную культуру микроорганизмов в питательной среде определенного состава, строго соблюдать технологию и исключить нежелательную микрофлору. Из сравнительно простых веществ-субстратов питательной среды с помощью микроорганизмов синтезируются сложные органические вещества. Отбирая особые культуры микроорганизмов, можно провести самые различные химические реакции – окисление и восстановление, аминирование, специфический гидролиз и множество других, проведение которых химическим путем очень трудно, а иногда невозможно.

В пищевой промышленности микроорганизмы используются при получении ряда продуктов. Так алкогольные напитки, вина, шампанские, пиво, коньяки, ликеро-водочные изделия и другие продукты брожения получают при помощью дрожжей. Немаловажную роль в народном хозяйстве играют также органические кислоты, такие как лимонная, уксусная, итаконовая и другие, получаемые микробиологическим путем. Молочная промышленность производить сметану, кефир, простоквашу и сыры.

Магистральным направлением биотехнологии является всемерная интенсификация производственных процессов. Это достигается не только на основе внедрения новых высокопродуктивных биообъектов, но и путем широкого применения эффективных технологических режимов. Необходимо подобрать подходящий субстрат, разработать конструкцию аппарата, оптимизировать условия культивирования биообъекта, обеспечить автоматический контроль за протеканием биотехнологического процесса, разработать способ выделения и очистки готового целевого продукта.

Современное биотехнологическое производство представляет собой сложные технологические системы, включающие большое количество аппаратов, где в определенной последовательности осуществляются периодические и непрерывные процессы, направленные на получение продуктов микробиологического синтеза. Системный подход к анализу такого производства – «биотехнологической системы» (БТС) – позволяет установить подчиненность функционирования отдельных составляющих системы, общей целевой задаче, взаимосвязь их между собой, а также целенаправленно использовать данные о количественных характеристиках отдельных составляющих системы для анализа и оптимизации системы в целом.

Структура и особенности биотехнологии могут охватывать отдельные операции или процесс в целом. Состав любой технологической системы: биотехнологический агент, субстрат, технологический режим, аппаратура для осуществления процесса, продукт.

Биологическим агентом биотехнологической системы может быть клетка (прокариот, эукариот) или вирусная частица. Субстратом является питательная среда для культивирования клеток, продуктом – биомасса клеток, вирусов или синтезируемое клетками вещество, которому при соответствующей обработке придается товарный вид. Одним из основных элементов аппаратурного обеспечения биотехнологического процесса является биореактор (аппарат-культиватор, ферментер). При определенных параметрах и режимах культивирования в биореакторах можно выращивать практически любые клетки.

Характеристика основных питательных сред. В зависимости от состава и назначения питательные среды подразделяют на ряд групп по консистенции: жидкие, полужидкие и плотные (твердые). К последним обычно относят агаризованные среды, хотя в качестве уплотняющих веществ можно использовать и другие вещества (желатин, селикагель, карбоксиметилцеллюлоза идр.). К плотным средам относятся также свернутая сыворотка, свернутый яичный белок и т.п.

Плотные среды в пробирках, колбах и других емкостях можно переносить не опасаясь замочить ватные пробки или повредить структуру колоний (например, пленку гриба или некоторых бактериальных культур). На плотных средах легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Для хранения микроорганизмов в производственных условиях, как правило, применяются плотные среды.

Однако, поскольку плотные среды получают, главным образом, включением в их состав агара, представляющего собой смесь двух полисахаридов, то этого иногда бывает достаточно для проявления роста некоторых культур (имеются данные о росте микроорганизмов на агаре, приготовленном только на одной воде, без добавления питательных веществ). Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучать влияние на культуру различных факторов, определять бактериальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды используют для проведения более точных исследований, их составом проще варьировать.

По строению и сложности питательные среды подразделяют на простые или обычные (пептонная вода, питательная желатина и др. их иногда называют универсальными), и сложные, политропные, или специальные (кровяной агар, асцитический агар (бульон), свернутая сыворотка).

По назначению питательные среды разделяют на дифференциально-диагностические, элективные, накопительные (среды обогащения, насыщения) ингибиторные, селективные, индикаторные, среды для консервирования. По составу выделяют натуральные, синтетические и полусинтетические.

Такое разделение сред во многих случаях условно и не всегда строго обосновано.

Приготовление жидких питательных сред. Жидкие питательные среды приготавливаются в реакторах с мешалкой. В зависимости от совместимости и растворимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы и их системы. Если в состав сред входят нерастворимые компоненты (мука, мел и др), технология средоварения усложняется (разваривание муки и т.п.), однако аппаратурная схема сохраняется. Реакторы выбираются с якорными или другого вида мешалками для взвесей. Для транспорта таких сред применяются специальные, допускающие наличие в среде взвесей насосы.

В конкретных технологиях могут быть применены специальные более сложные схемы и аппаратура для получения сред. Так, например, при производстве хлебопекарных дрожжей мелассные среды для получения нужного качества продукта специально осветляются. При производстве пива и этанола процесс средоварение включает осахаривание крахмала. Мучные среды могут быть подвергнуты дезинтеграции. Нередко в состав сред входят экстракты или гидролизаты каких-либо продуктов, получение которых также относится к процессу средоварения. Если в рецептуру входят слаборастворимые ингредиенты, процесс эмульгирование также относится к средоварению.

Весьма сложно и специфично приготовление сред для объектов нетрадиционной биотехнологии – гибридом, клеток костно-мозгового происхождения и других тканевых культур. Исключительно большое значение в этом случае имеет материал поверхностей, соприкасающихся с данными питательными жидкостями. Однако большинство этих процессов пока осуществляется в лабораторных масштабах, что значительно облегчает их реализацию.

Стерилизация питательных сред. В настоящее время доминирует термический метод стерилизации питательных сред. Холодная стерилизация (фильтрация) применяется для термолабильных компонентов. Эти среды не должны содержать нерастворимых веществ.

Наиболее часто применяемая принципиальная схема стерилизации включает подогрев среды острым паром (в стерилизационной колонке) с последующим ее выдерживанием при нужной температуре и охлаждением. Такая схема проста и эффективна, однако ее эксплуатация связана со сравнительно большим расходом тепла. Для экономии тепловой энергии линии стерилизации комплектуют из теплообменника для подогрева питательной среды до 80-900С охлаждаемой стерильной средой, парового енжектора (паровой колонки) для повышение температуры стерилизации острым паром, выдерживателя, расширителя, в котором происходит быстрый сброс температуры среды до 90 – 950С, теплообменников для конденсации пара из расширителя и окончательного охлаждения питательной среды до температуры ферментации. Применяют также упрощенные варианты этой схемы, в том числе объемные выдерживатели без расширителя.

Время стерилизации среды (выдержку) регулируют путем изменения длины трубы или количества теплообменников, температуру – подачей пара на подогрев. Для сред, содержащих термолабильные компоненты, необходимое время выдержки составляет иногда 18-20 мин при сравнительно низкой температуре, что трудно реализовать в проточных выдерживателях.

Контрольно-измерительная и управляющая аппаратура линии стерилизации размещена на отдельном пульте управления или на общем пульте цеха ферментации.

Посевные питательные среды рекомендуется стерилизовать, а также приготавливать непосредственно в посевных ферментаторах. Последнее упрощает аппаратуру и уменьшает вероятность получения нестерильной культуры.

Субстраты для культивирования биообъекта. Традиционные методы поддержания культур микроорганизмов сводятся у их выращиванию на богатых питательных средах с частыми пересевами. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов, эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью питательной среды служит вода, все процессы жизнедеятельности протекают только в водной среде. Питательные вещества образуют в среде истинные (минеральные соли, сахара, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты и альдегиды и т.д.) или коллоидные (белки, липиды, неорганические соединения типа гидроксида железа) растворы. Отдельные компоненты питательной среды могут находиться в твердом агрегатном состоянии, они могут всплывать на поверхность раствора (частицы угля, серы) равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси или образовывать придонный осадок. Жидкие углеводороды при внесении в воду формируют особую несмешивающуюся фазу. При твердофазном культивировании вода только увлажняет твердую поверхность субстрата. Вещества, необходимые для культивирования, могут представлять собой газы, растворимые в воде.

Питательные среды могут иметь определенный состав и включать биогенные (растительные, животные, микробные) добавки, такие как мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Подобные среды обычно готовят на водопроводной воде. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях, так называемые синтетические среды. Смесь веществ, как правило, вносят в дистиллированную воду.

С экономически точкой зрения наиболее целесообразно употребление природного, более дешевого сырья, а не смеси веществ, полученных в чистым виде. Однако применение сред строго определенного состава позволяет точно регистрировать и регулировать протекающие в биореакторе процессы, добиваться их оптимизации.

Компонентный состав среды зависит от пищевых потребностей биообъекта. Автотрофные организмы синтезируют органические вещества клеток из СО2 и Н2О с утилизацией энергии света (фотоавтотрофы) или химических реакций окисления (хемоавтотрофы), поэтому питательные среды для таких биообъектов могут не содержать органических соединений. Несложен рецепт приготовления среды для хемоавтоторфных организмов, вызывающих окисление металлов в рудах и тем самым переводящих их в растворимое состояние (выщелачивание металлов из руд). Породу, из которой требуется извлечь остаточные количества ценного металла, обливают водой, а соответствующие микроорганизмы развиваются в породе без каких-либо дальнейших добавок.

Во многих разработках используют биообъекты, требующие органические источники углерода и (или) энергии.

С технико-экономической точки зрения субстрат представляет собой сырье для получения целевого продукта. Сырье должно быть недефицитным, недорогим, по возможности легко доступным. Хорошим примером недефицитного и дешевого сырья служит меласса, побочный продукт производства сахара. Распространнными источниками углерода и энергии являются компоненты нефти и природного газа. Большое внимание уделяют различным видам растительной массы: плодам, сокам, клубням, травяной массе, древесине. Применяют отходы сельскохозяйственной и бумажной промышленности, что позволяет реализовать с помощи биотехнологии принцип безотходного производства. На отходах, остающихся при микробиологическом получении этанола, можно выращивать кормовые дрожжи. Разработан способ получения биомассы, при котором на гидролизатах растворимого сырья выращивают дрожжи, а фильтрат культуральной жидкости затем идет на синтез грибного белка. Предполагают использовать биомассу одного вида организма на субстрат культивирования другого.

Используемые в биотехнологии субстраты и получаемые продукты многообразны и предназначены для специфического применения.

Выделение и очистка продукта. Одних из важных стадий биотехнологического процесса является выделение целевого продукта. Это стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается ли продукт в клетке, выделяется в культуральную жидкость или же продуктом является сама клеточная масса. Технология выделения и очистки зависит от природы целевого продукта. Ферменты выделяют путем осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония. Имеется возможность обойтись без их полной очистки, поскольку в народном хозяйстве широко используются смешанные ферментные препараты, содержащие несколько белков, близких по физико-химическим свойствам.

Литература:

Основная – 2 [3-65, 80-92].

Дополнительная – 2 [5-20].

Контрольные вопросы:

1.Назовите цель и задачи биотехнологии как науки.

2.Какие биосистемы и объекты используют в биотехнологии?

3.Характерные особенности биотехнологических процессов.

4.Основные компоненты биотехнологических систем.

Лекция №2.

Процессы биотехнологического производства

Выделение и очистка продуктов. Одной из важных стадий биотехнологического процесса является выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается ли продукт в клетке, выделяется в культуральную жидкость или же продуктом является сама клеточная масса. Технология выделения и очистки в значительной степени зависит от природы целевого продукта. Ферменты выделяют путем осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония. Имеется возможность обойтись без их полной очистки, поскольку в народном хозяйстве широко используются смешанные ферментные препараты, содержащие несколько белков, близких по физико-химическим свойствам. В то же время такие ферменты, как эндо- и экзануклеады, лигазы требует сложной многоэтапной очистки с применением методов препаративного разделения.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков и флокулянтов для более эффективного отделения биомассы и стабилизации продуктов.

Существуют различные методы сепарации.

Флотация. Метод может быть применен, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Повышение эффективности отбора биомассы в виде концентрированной суспензии достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.

К достоинствам метода относятся экономичность, высокая производительность и возможность применения в условиях непрерывного процесса.

Фильтрация. Все фильтры, применяемые в настоящее время , подразделяются на следующие виды: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум- фильтры, фильтр-прессы, мембранные. Принцип, применяемый в их действии один и тот же, он заключается в задержании биомассы на пористой фильтрующей перегородке.

Центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Центрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Широко применяют центрифуги, где разделение твердой и жидкой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе. Используемые центрифуги различных типов, классифицируются по скорости вращения сосуда (стакана) для разделения биомассы и культуральной жидкости, по способу выгрузки осевшей биомассы и по другим критериям. Наиболее перспективны для осаждения биомассы центрифуги-сепараторы, в которых биомасса оседает на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки.

Концентрирование продукта. За отделением продукта следует его концентрирование. Основные методы концентрирование биологического продукта – это обратный осмос, ультрафильтрация и выпаривание.

Если к раствору приложить внешнее давление, превышающее осмотическое, то растворитель вытекает через полупроницаемую мембрану против градиента концентрации растворенного вещества, т.е. происходит дальнейшее концентрирование раствора.

Ультрафильтрация – отделение вещества с помощью мембранных фильтров. Технология ультрафильтрации подкупает своей простотой, относительной экономичностью и мягким щадящим обращением с продуктом. Здесь не требуется изменение рН, ионной силы раствора или перевода продукта в другую форму. Этим объясняется перспективность ультрафильтрации для концентрирование таких малостабильных продуктов, как молочная и глутаминовая кислоты, витамин В12, некоторые антибиотики и ферменты.

Методы выпаривания предполагают концентрирование биологической массы в результате испарения растворителей. Однако они обладает очевидным недостатком: для удаления воды или иного растворителя необходимо нагревать. В производственных условиях чаще используют вакуум-выпарные аппараты, в которых и температура выпаривания и вред, причиняемый веществам, могут быть снижены в зависимости от уровня снижения давления. Перспективные методы выпаривания чувствительных к нагреванию веществ состоят в использовании дисковых и пленочных выпарных аппаратов, в которых испарение стимулируется в результате растекания жидкости тонким слоем по нагретой поверхности.

Выпаривание может быть ограничено стадией получения густого сиропообразного раствора целевого продукта. Это называется упариванием. Исчерпывающее удаление влаги ведет к получению сухого продукта, и технология выделяется в особую стадию обезвоживания продукта.

Обезвоживание продукта. Наиболее старым методом обезвоживания можно считать сушку на подносах. Для сушки термостабильных антибиотиков и аминокислот применяют ленточную сушку. В данном случае подносы заменяются на ленточный конвейер, а ленту постоянно подогревают.

Сушка в кипящем слое. Газообразный нагревающий агент (пар, воздух, СО2) мощной струей врывается в сушильный аппарат снизу, и частицы продукта биосинтеза парят в газовом потоке. Преимуществом метода является возможность регулирования в широких пределах продолжительности пребывания материала в аппарате, интенсивности массопередачи и теплообмена, возможность организовать непрерывный процесс при простой конструкции аппарата. Ограничение состоит в том, что материал не должен приставать к стенкам сушильного аппарата. Метод пригоден для сушки антибиотиков, аминокислот, крахмала, но не суспензией клеток.

Барабанные сушилки, в которых обезвоживают микробные суспензии, состоят из вращающихся подогреваемых барабанов, погруженных в сосуд с суспензией. Соприкасаясь с барабаном, суспензия нагреваясь обезвоживается и присыхает в виде пленки к его стенкам. Высохшую биомассу соскребают со стенок специальными ножами.

Особо чувствительные к нагреву материалы сушат в вакуум-сушильных шкафах при пониженном давлении и температуре.

Распылительные сушилки превращают раствор или суспензию в аэрозоль путем пропускания под давлением через форсунку на вращающийся диск.

Полученный сухой продукт после предания ему товарного вида поступает на хранение. На этом этапе возможен также вариант химической модификации.

Пути модификации продукта. Химическая модификация необходима в тех случаях, когда биотехнологический процесс сам по себе дает лишь «заготовку» целевого продукта. Так, антибиотик, продуцируемый микробной культурой, путем химических построек может быть превращен в различные медицинские препараты.

Иногда биообъект участвует лишь в одном каком-либо этапе цепи химических процессов, ведущих к синтезу целевого продукта. Например, придание продукту оптической асимметрии позволяет избежать трудоемких последующих химических синтезов.

Модификация являющаяся необходимым этапом в получении ряда ферментов, гормонов и препаратов медицинского назначении, часто играет важную роль при перестройке соединений животного, растительного и микробного происхождения, сцелью придание им специфических свойств, необходимых человеку. Так, например, «остриганием» аминокислотных остатков бычьего инсулина получают модифицированное соединение идентичное человеческому гормону.

Стабилизация продукта и его хранение.

Мероприятия направленные на сохранение свойств продукта в период его хранения и использование его потребителем, включают различные физико-химические воздействия на продукт, в том числе и стабилизацию К стабилизации различных продуктов, в том числе кормового микробного белка, ведет добавление наполнителей из грибкового мицелия, пшеничных отрубей, кукурузной муки, которые сами обладают питательной ценностью. Стабилизация, например, ферментов достигается добавлением глицерина или углеводов, которые образуют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствующие спонтанной или (при длительном хранении) или индуцированной нагреванием денатурации ферментов. В некоторых случаях стабилизация не обеспечивается физико-химическими средствами и представляет собой задачу особого биологического процесса. Меланж, получаемый из яичных желтков, является ценным пищевым продуктом, которым быстро портится – темнеет и теряет свою пищевую ценность через несколько месяцев хранения. Порча меланжа может быть предотвращена, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «выедающие» углеводы, что приводит к значительному удлинению срока хранения меланжа. В то же время пропионовые бактерии сами повышают питательную ценность меланжа, обогащая его органическими кислотами и витамином В12.

Поддерживание биообъекта в рабочем состоянии и сохранение его ценных свойств являются важной биотехнологической проблемой. Длительное хранение клеток без утраты ценных свойств возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы, в том числе и генетические перестройки. Для этих целей используются следующие методы:

1.Лиофильное высушивание клеток (обезвоживание под вакуумом после замораживания при температурах (-40) – (-60)0С и ниже. Метод рекомендуется для хранения продуцентов антибиотиков. В лиофилизированном состоянии менее жизнестойкие отмирают, популяция обогащается более жизнеспособными;

2.Высушивание на воздухе в стерильной почве, песке, на активированном угле и других носителях. Применение этого метода позволяет избежать генетических изменений;

3.Сохранение спор (пригоден для спорообразных бактерий);

4.Криоконсервация – глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (-1960С) или его парах (-1500С);

5.Комбинированные методы хранения;

Для сохранения ценных свойств биообъектов проводятся следующие мероприятия:

- создаются щадящие условия в биореакторе, максимально приближенные к условиям в лабораторном культиваторе;

- применяются антимутагены – вещества, снижающие частоту спонтанных мутаций;

- испльзуются продуценты с так назыавемыми многократно выраженными мутациями;

- создаются селективные условия, в которых преимущество получает интересующий нас штамм.

К сожалению, ни один из рассмотренных методов борьбы с утратой ценных свойств биообъектов на сегодняшний день не дает 100%-ную гарантию

Литература:

Основная – 2 [82-97, 197-232.

Дополнительная – 6 [181-190].