Практическая работа №4. ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ И ПОДДЕРЖАНИЕ
ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ И ПОДДЕРЖАНИЕ
ИХ НАТИВНОЙ КОНФОРМАЦИИ В УСЛОВИЯХ КЛЕТКИ
Денатурация белков- это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка.
1 Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отличную от других таких же молекул.
2 Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом.
3 Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок.
При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры. Вспомните условия, в которых происходит гидролиз пептидных связей.
Таблица 4.1Реагенты и условия, вызывающие денатурацию белков
| Денатурирующие агенты | Особенности действия реагента |
| Высокая температура (выше 60°С) Кислоты и щелочи Мочевина Спирт, фенол, хлорамин Соли тяжелых металлов | Разрушение слабых связей в белке Изменение ионизации ионогенных групп, разрыв ионных и водородных связей Разрушение внутримолекулярных водородных связей в результате образования водородных связей с мочевиной Разрушение гидрофобных и водородных связей Образование нерастворимых солей белков и ионов тяжелых металлов |
ПРИМЕНЕНИЕ ДЕНАТУРИРУЮЩИХ АГЕНТОВ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И МЕДИЦИНЕ
В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений обычно из раствора удаляют белки. Для этой цели чаще всего используется трихлоруксусная кислота (ТХУ). После добавления ТХУ в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием (таблица 4.1).
В медицине денатурирующие агенты часто применяют для стерилизации медицинского инструмента и материала в автоклавах (денатурирующий агент - высокая температура) и в качестве антисептиков (спирт, фенол, хлорамин) для обработки загрязненных поверхностей, содержащих патогенную микрофлору.
Молекулярные шапероны предотвращают денатурацию белков
1 Так как конформация белков поддерживается благодаря слабым связям, в условиях клетки они могут денатурировать, хотя и с меньшей скоростью, чем при высокой температуре.
2 Самопроизвольная ренативация белков затруднена, так как из-за их высокой концентрации существует большая вероятность агрегации частично денатурированных молекул.
3 В клетках имеются белки - молекулярные шапероны,которые обладают способностью связываться с частично денатурированными, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии белками и восстанавливать их нативную конформацию.
4 Вначале эти белки были обнаружены как белки теплового шока,так как их синтез усиливался при стрессовых воздействиях на клетку, например при повышении температуры.
Шапероны (Ш) классифицируются по массе субъединиц. Высокомолекулярные шапероны имеют массу от 60 до 100 кД. Среди них наиболее изучены три класса: Ш-60, Ш-70 и Ш-90. Каждый класс включает семейство родственных белков.
Различные семейства шаперонов, обнаруженные практически во всех отделах клетки, участвуют в таких фундаментальных процессах:
1)ренативация частично денатурированных белков;
2)узнавание денатурированных белков и транспорт их в лизосомы;
3)синтез белков;
4)формирование трехмерной структуры белков;
5)сборка олигомерных белков;
6)транспорт белков через мембраны;
7)функционирование белковых комплексов и контроль за изменением между активной и неактивной конформацией.
Задания
1 Белки клеток, находясь в водном растворе, приобретают конформацию, при которой большая часть гидрофобных радикалов ориентирована внутрь молекулы. Многие же антисептические средства содержат в своем составе гидрофобные группы.
А. Объясните возможный механизм их бактерицидного действия.
Б. Сравните строение двух антисептических средств. Какой из препаратов лучше растворяется в воде?
 |
Какой из них должен оказывать более сильное бактерицидное действие?
2 Мышьяковистый ангидрид применяют в стоматологической практике для некротизации пульпы. На чем основано это действие?
3 Денатурация белка сопровождается:
А) Разрывом ковалентных связей.
Б) Изменением конформаций белка.
В) Уменьшением растворимости белка.
Г) Нарушением связывания белка с лигандом.
Д) Нарушением первичной структуры белка.
4 Белки денатурируют в клетке в результате (выберите правильные ответы):
А) Повышения температуры.
Б) Изменения рН.
В) Действия протеолитических ферментов.
Г) Разрыва слабых связей, поддерживающих конформацию белка.
Д) Синтеза белков теплового шока.
А) Нативная рибонуклеаза.
Б) Денатурированная рибонуклеаза.
В) Обе.
Г) Ни одна.
1 Молекулы белка имеют одинаковую конформацию.
2 Молекулы белка имеют одинаковую первичную структуру.
3 У молекул нарушено связывание с природным лигандом.
4 Молекулы имеют различную молекулярную массу.
6 Денатурация белков как следствие их конформационной лабильности.
а) Все молекулы одного индивидуального белка:
1 Имеют одинаковую конформацию.
2 Имеют одинаковую первичную структуру.
3 Имеют случайную конформацию.
4 Способны специфично взаимодействовать с разными лигандами.
А) Нативный белок.
Б) Денатурированный белок.
В) Оба.
Г) Ни один.
б) Решите задачу. Денатурация цистеинсодержащих белков кислородом воздуха.
В состав многих белков входят остатки цистеина, SН-группы которых располагаются на поверхности молекул. При контакте белков с О2 воздуха происходит окисление SН-групп, в результате образуются дисульфидные связи, нехарактерные для нативной структуры белка. Почему функциональная активность белков при этом падает?
Опишите, что происходит с белками, используя ключевые слова: слабые связи, конформация, активный центр, лиганд, функция белка.
4.2 Контрольные вопросы
1 Что такое денатурация и ренатурация? Приведите примеры обратимой и необратимой денатурации. Чем может быть вызвана денатурация?
2 Механизм денатурации.
3 Шапероны.