Питательные среды для культивирования франциселл

Пептон-цистеиновый агар. В 1 л дистиллированной воды растворя­ют 20 г пептона, 10 г натрия хлорида, 1 г глюкозы, 1 г хлористоводородного цистеина. Добавляют 20 г агар-агара. Нагревают до закипания и кипятят 1 минуту. Разливают в чашки, проверяют на стерильность выдер­живанием чашек при 37°С 24 ч.

Свернутая желточная среда (МакКой-Чепин). К 20 мл изотони­ческого раствора натрия хлорида рН 7—7,2 добавляют 20 мл аутолизата пивных дрожжей и 60 мл желтка куриных яиц. Перемешива­ют, разливают в чашки или пробирки и выдерживают 1 ч при 80°С.

Приготовление аутолизата пивных дрожжей. Пивные дрожжи отмывают от сусла водопроводной водой. Сливают в колбу и помещают на 24 ч в водяную баню при 56-58°С. Кипятят 20 минут. Подщелачивают гидроокисью натрия до слабощелочной реак­ции. К 1 части аутолизата дрожжей добавляют 2 части воды, кипятят 40 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают в колбы и сте­рилизуют при 120°С 30 минут.

Мартеновский дрожжевой агар. К 930 мл мартеновского бульона добавляют 70 мл аутолизата пивных дрожжей, 10 г глюкозы, 1 г цисте­ина, 0,4 г хлорида калия, 3 г хлорида натрия, 0,1 г натрия бикарбоната, 0,3 г магния сульфата, 0,8 г натрия фосфата двуосновного. Доводят рН смеси раствором гидроокиси натрия до 7,2-7,4. Добавляют 30 г агар-агара, кипятят до его расплавления. Разливают в пробирки и стерили­зуют 20 минут при 120°С.

Среда Емельяновой. К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 мл гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатина, 2,5 мл ауто­лизата пивных дрожжей, 0,5 г натрия хлорида, 1 г глюкозы, 0,1 г цистеина и 2 г агар-агара. Нагревают до расплавления агара. Разливают в кол­бы и стерилизуют 20 минут при 120°С. Перед употреблением в расплав­ленную среду добавляют 10% дефибринированной крови кролика и разливают в чашки.

Полужидкая среда Дрожевкиной. К 90 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида рН 7,0-7,2 асептически добавляют 10 мл суспензии желтка куриных яиц, перемешивают и разливают в пробир­ки. После проверки на стерильность используют.

Среда Ухалова-Михалевой. К 100 мл основного перевара Хоттингера добавляют 250 мл сычужного пептона, 4 г натрия хлорида и ки­пятят 3 мин. Устанавливают рН 7,2-7,4, вновь кипятят 3 минуты и фильт­руют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 20 г предвари­тельно замоченного агар-агара и нагревают до его расплавления. Раз­ливают в колбы, стерилизуют 20 минут при 120°С.

Приготовление сычужного пептона. К 400 г свеже­приготовленного фарша из обезжиренного сычуга крупного рогатого скота добавляют 1 л 1%-ного раствора соляной кислоты. Встряхивают и оставляют на 2-3 суток при 46-48°С до образования на дне бутылки порошкообразной массы и появления положительной реакции на триптофан. Смесь прогревают 10 минут при 80°С на водяной бане. Отстояв­шийся от осадка прозрачный раствор пептона декантируют, добавляют 2% хлороформа. Хранят при 10°С.

Среда Анциферова. К 100 мл расплавленной и охлажденной до 45°С среды Ухалева-Михалевой добавляют 5 мл (3:2) желтка ку­риных яиц в 0,5% растворе хлорида натрия. Разливают по пробир­кам и скашивают при нагревании до 65°С.

Среда Френсиса. К 100 мл мясного настоя добавляют 1 г пептона, 0,5 г натрия хлорида, 1,5-2% агар-агара и нагревают его до расплавле­ния. Вносят 0,1 г цистеина, 1 г глюкозы. Устанавливают рН 7,2-7,4. Сте­рилизуют при 110°С 30 минут. В расплавленную после стерилизации и охлажденную до 45°С среду добавляют 5-10% дефибринированной крови кролика. Разливают по пробиркам и чашкам.

Микроорганизмы рода Yersinia

Общая характеристика

Род Yersinia организован в 1946 году и назван (по предложению ван Логхема) в честь Александра Иерсена. Ранее бактерии данного рода относили к роду Pasteurella. Сейчас род Yersinia включает микроорганизмы 11 видов (Y. aldovae, Y. bercow, Y. enterocolitica, Y. fredenksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei и Y. ruckeri), типовой вид — Y. рestis. С 1954 г бактерии рода Yersinia включены в семейство Enterobacteriaceae.

Морфология

Наиболее часто клетки иерсинии имеют овоидную форму (коккобациллы), с повышением температуры культивирования (от 37^оС) бактерии имеют чаще форму палочек. Окрашиваются грамотрицательно, возможна биполярная окраска (может служить дифференциальным признаком при исследовании на Y.pestis). Палочки склонны к полиморфизму, образуя в субоптимальных условиях нитевидные, колбовидные или шарообразные (инволюционные) формы (например, на агаре с содержанием поваренной соли). В зависимости от вида (некоторые штаммы Y. ruckeri и вид Y. рestis) и температуры культивирования они могут быть подвижными и неподвижными споронеобразующими палочками (иногда коккобациллами) размерами 1-3´0,5-0 8 мкм. Бактерии не­подвижны при 37°С, но подвижны при выращивании с температурным режимом ниже 30°С (подвижные виды - перитрихи). Некоторые штаммы Y. ruckeri и все изоляты Y. pestis неподвижны (но броуновское движение очень выражено) и имеют капсулу, а остальные виды – капсульное вещество.

Для Y. pestis характерны морфологически обособленный нуклеоид, наиболее хорошо видимый у инволюционных гигантских клеток и отсутствие подвижности.

Виды Yersinia образуют се­ровато-слизистые (S-формы) или шероховатые R-колонии, также выделяют переходные формы. Вирулентные штаммы образуют R-колонии. Микроскопическое изучение колоний Y. pestis выявляет колонии двух типов: молодые — микроколонии с неровными краями («битое стекло»), позднее они сливаются, образуя нежные плоские образования с фестончатыми краями («кружевные платочки»), зрелые — крупные с бурым зернистым центром неровными краями («ромашки»). Многие, особенно вирулентные, штаммы Y. pestis спо­собны образовывать темный пигмент, восстанавливать красители (янус зеленый, индиго, метиленовый синий) в реакциях дегидрирования. На скошенном агаре через 48 ч при 28° С образуют серовато-белый налет, врастающий в среду. На бульоне через 48 ч образуют нежную пленку на поверхности и хлопьевидный осадок, при выращивании в аэри­рованном бульоне дают гомогенный рост, также хорошо растут на желатине, не вызывая ее разжижения.

На плотных средах колонии Y. enterocolitica мел­кие, блестящие, часто выпуклые с голубоватым оттенком в проходящем свете. При культи­вировании (48 ч при 37°С) на среде Эндо колонии имеют розоватый оттенок. Полиморфизм колоний выражен слабо. При старении у Y.enterocolitica часто отмечают сливной рост. Бактерии проявляют пектиназную активность, на пектиновом агаре колонии окружены зо­ной разжижения. При культивировании на жидких средах микроорганизм вызывает их по­мутнение. Принято считать, что вирулентные штаммы иерсиний образуют преимущественно R-колонии, но для Y.enterocolitica образование шероховатых колоний нехарактерно.

Колонии Y.pseudotuberculosis отличают серовато-желтоватый оттенок в проходящем свете и меньшая прозрачность. При культивировании (48 ч при 37°С) на среде Эндо колонии Y. pseudotuberculosis остаются бесцветными. Часто образуют R-формы — выпуклые, бугрис­тые, с фестончатой зоной (или без нее), напоминающие колонии Y. pestis. При старении колонии увеличиваются в размере и теряют прозрачность. На бульоне диссоциированные культуры Y.pseudotuberculosis растут в виде хлопьевидного осадка, оставляя среду прозрач­ной, а гладкие — вызывают ее равномерное помутнение. Факультативные анаэробы, метаболизм окислительный и бро­дильный, паразиты человека и животных. Температурный оптимум — 25-28°С; оксидазоотрицательны и каталазоположительны, образование индола варьирует у разных видов, большинство изолятов дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра при 37°С, но вариабельную при 25-28°С. Большинство не образует лизиндигидролазу и аргининдекарбоксилазу, но синтезирует орнитиндекарбоксилазу (исключая Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.rohdei). He образуют H₂S, проявляют уреазную активность (исключая Y. pestis, Y. bercovieri и Y. ruckeri). Хемоорганотрофы; хорошо растут на простых питательных средах, ферментируют большинство углеводов (исключая лактозу) без образования газа, не сбраживают дульцит, эритрит, фукозу, гликоген, инозит, раффинозу, проба с метиленовым синим положительна. Основные признаки видов представлены в табл. 15; при идентификации следует помнить, что иерсинии способны суще­ственно изменять свой метаболизм в зависимости от температуры (табл. 16). Иерсинии широко распространены в природе, некоторые из них — паразиты различных животных (осо­бенно грызунов и птиц) и человека; их также выделяют из почвы, воды и пищевых продуктов. Y.pestis вызывает чуму, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica патогенны для различных животных и иногда для человека, вызывают брыжеечный лимфаденит, хроническую диарею и тяже­лые септицемии. Y. ruckeri вызывает «болезнь красного рта» у рыб, прочие виды не патогенны; либо вызывают оппортунистические инфекции у человека (табл. 14).

Таблица 14. Непатогенные иерсинии, выделяемые у человека

Вид	Источник выделения
Y. intermedia	Кровь, испражнения, отделяемое глаз, моча, раневое отделяемое, содержимое абсцессов, синовиальная жидкость
Y. frederiksenii	Кровь, испражнения, гнойное отделяемое
Y. kristensenii	Испражнения, отделяемое глаз
Y. rohdei	Испражнения
Y. mollaretii	Испражнения
Y. bercovieri	Испражнения

Таблица 15. Дифференциальные признаки бактерий рода Yersinia

Тест или субстрат	Yersinia bercovieri	Yersinia enterocolitica	Yersinia frederiksenii	Yersinia intermedia	Yersinia kristensenii	Yersinia mollaretii	Yersinia pestis	Yersinia pseudotuberculosis
Образование индола	–	+	+	+	±	–	–	–
Реакция Фогеса-Проскауэра	–	±	±	–	–	–	–	–
Цитрат Симмонса	–	–	+	+	–	–	–	–
Уреазная активность	+	+	+	+	+	+	–*	+
Орнитин декарбоксилаза	+	+	+	+	+	+	–	–
Ферментация мелибиозы	–	–	–	+	–	–	±	+
Ферментация раффинозы	–	–	–	+	–	–	–	±
Ферментация сорбита	+	+	+	+	+	+	–	–
Ферментация сахарозы	+	+	+	+	–	+	–	–
Ферментация рамнозы	–	–	+	+	–	–	–	+
Ферментация муката	+	–	±	±	–	+	–	–

* Возможна положительная реакция у свежевыделенных штаммов.

В данном разделе использованы результаты диссертационной работы Д.А.Померанцева.

Таблица 16. Дифференциальные признаки бактерий рода Yersinia в зависимости от температуры культивирования (25-28°С / 37°С)

Тест или субстрат	Y. bercovieri	Y. enterocolitica	Y. frederikseilii	Y. intermedia	Y. krislensenii	Y. mollaretii	Y. pestis	Y. pseudotuberculosis
Реакция Фогеса-Проскауэра	–/–	+/–	+/–	+/–	–/–	–/–	–/–	–/–
Цитрат Симмонса	±/–	–/–	±/–	–/–	–/–	–/–	–/–	–/–
Подвижность	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	–/–	+/–
Ферментация мелибиозы	–/–	–/–	–/–	±/+	–/–	–/–	±/–	+/±
Ферментация раффинозы	–/–	–/–	–/±	+/±	–/–	–/–	–/–	±/±
Ферментация рамнозы	+/–	–/–	+/+	+/+	–/–	–/–	–/–	+/±
Ферментация салицина	–/±	±/±	+/+	+/+	–/±	±/±	±/±	±/±
Ферментация муката	+/–	–/–	±/–	±/–	–/–	+/–	–/–	–/–
Гидролиз эскулина	+/±	±/±	+/±	+/±	–/–	±/–	+/±	+/+
Уреазная активность	+/±	+/±	+/±	+/±	+/±	+/*	–/–	+/+

Температурные пределы роста иерсиний варьируют от 0 до 39°С (для Y.pestis до 45°С); оптимум роста — 28-30°С; температура 37°С — селективная для образования капсулы Y.pestis. Границы рН для роста — в пределах 5,8-8,0; оптимум рН — 6,9-7,2. Хорошо растут на простых питательных средах, медленный рост бактерий (до 3 суток) можно ускорить добавлением гемолизированной крови или сульфата натрия (Y. pseudotuberculosis практически не растут на среде Плоскирева). Наиболее благоприятная температура для выделения Y. enterocolitica — 22-29°С. На средах для изучения подвижности (например, содержащих индол и орнитин) Y. enterocolitica неподвижны или малоподвижны при 35°С и подвижны при 25°С.

Антигенная структура

Все виды иерсинии имеют O-Аг (эндотоксин), похожий на Аг многих грамотрицательных бактерий и токсичный для животных и человека. Липополисахаридно-белковые комплексы O-Аг разделяют на основе химических и антигенных характеристик на «гладкие» (S) и «шероховатые» (R); последние — общие для Y.pseudotuberculosis и Y.pestis. Все штаммы Y. enterocolilica обладают поверхностным Аг энтеробактерий, общим с пред­ставителями семейства. Имеются публикации о наличии у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolilica продуктов, напоминающих экзотоксины.

У Y. pestis выделяют разнообразные (до конца неисследованные) Аг, роль которых как факторов вирулентности неясна.

Фракция 1 ( Fl ) – капсульный антиген, представлен поверхностным гликопротеиновым Аг. Он предохраняет бактерии от поглощения полиморфно – ядерными лейкоцитами, не оказывает токсического действия, но проявляет иммуногенные свойства.

Активатор плазминогена — протеаза, активирующая лизис фибриновых сгустков, препятствующих диссеминированию возбудителя, и инактивирующая СЗЬ и С5а компо­ненты комплемента.

V/W( Vi )-Aг Y.pestis состоит из белка (V-фракции) и липопротеина (W-фракции); прояв­ляет антифагоцитарные свойства и способствует внутриклеточному росту бактерий. Штаммы Y. pestis, содержащие только V/W-Аг, вирулентны для мышей.

Мышиный токсин представлен белковоподобным веществом, локализованным внутриклеточно; LD₅₀ для мышей — менее 1 мг (также токсичен для крыс), вызывает шок и смерть, эффект — антагонист адренергических рецепторов.

Показана способность Y. pestis выделять бактериоцины (пестицин I и пестицин II), обладающие иммуногенными свойствами и оказывающими бактерицидное действие на Y. pseudotuberculosis и некоторые штаммы Escherichia coli.

Чума. Y. pestis вызывает чуму (от арабского «джумма») — зооантропоноз, поражающий грызунов (основной природный резервуар) и проявляющийся спорадическими вспышками или эпидемиями (эпизоотии). Человеку передается через блох, а также контактным, алиментарным и аспирационным путями; также опасны вторично загрязненные объекты и тру­пы. Эпидемии чумы известны с III в. до н.э., иногда они приобретали характер пандемии. Первая достоверная пандемия 527-565 гг. («юстинианова чума»), начавшаяся в Египте и Эфиопии, привела к огромным потерям среди населения Восточной Римской империи, но самой опустошительной была вторая пандемия чумы в XIV-XV вв., вошедшая в историю под названием «великой» или «черной» смерти и унесшая около 60 миллионов жизней, только в Европе погибло более 25 миллионов человек. Как последствие второй пандемии рассматривают эпидемию чумы в Лондоне (1664-1665 гг.), повлекшую смерть 20% населе­ния. Третья пандемия началась в Гонконге в 1894 г., продолжалась около 20 лет и унесла жизни 10 миллионов человек. В самом ее начале были сделаны важные открытия (выделен возбудитель, доказана роль крыс в эпидемиологии чумы), что позволило организовать про­филактику на научной основе. Возбудитель чумы обнаружили Г.Н. Минх (1878) и независи­мо Иерсин и Китазато (1894). Большой вклад в изучение эпидемиологии чумы внесли исследования Л.М. Исаева и Н.Н. Клодницкого, а также И.И. Мечникова, руководившего работой противочумных отрядов в Астраханской губернии (1911 г.). В 40-х гг. в Северной Африке была отмечена последняя эпидемическая вспышка; тем не менее, с 1958 по 1979 гг. в мире зарегистрировано 47 000 случаев чумы. Последние вспышки были в Индии (вторая половина 90-х гг.)

В эпидемиологическом отношении первое место занимают крысы (как самые распрост­раненные и многочисленные грызуны); основную роль играют три вида — серая крыса-пасюк (Rattus norvegicus), черная крыса (Rattus rattus) и египетская крыса (Rattus alexandrinus); чумные эпизоотии среди крыс обычно предшествуют заболеваниям людей. В степных регионах (где крыс мало) ведущую роль играют суслики, сурки и песчанки; общий список диких грызунов включает около 240 видов и подвидов, не считая синантропных крыс и мышей. При эпизоотиях среди мышей определенная роль в переходе заболевания на людей может принадлежать кошкам. Длительное время господствовало мнение, что чума (город­ская чума) среди синантропных крыс первична, а в дикой природе (дикая чума) — вторична, однако выявление эндемичных очагов в областях, практически свободных от крыс (например, в провинциях Северной Индии), показало ошибочность подобных воз­зрений. Группу риска по заболеваемости «дикой» чумой составляют охотники и заготови­тели животного сырья. Часто «дикая» чума и большинство случаев «городской» чумы протекают в виде бубонных поражений.

В передаче чумы человеку ведущую роль играют взрослые особи крысиных блох (Xenopsylla cheopsis), пожизненно сохраняющие возбудителя (общий список видов и форм блох, из которых выделяют возбудителя, насчитывает около 100 видов). Повсеместное вытеснение пасюком черной крысы сыграло, применительно к эпидемиологии чумы, по­ложительную роль. На серых крысах паразитируют блохи Ceratophilus fasciatus, живу­щие преимущественно в норах грызунов, а не в их шерсти и гораздо реже перебирающи­еся на человека, чем блохи черных крыс. Показано, что человек заражается не столько при укусе, сколько после втирания в кожу ее фекалий или масс (контаминированных бактериями), срыгиваемых при пита­нии. Установлено, что бактерии, размножающиеся в кишечнике блохи, выделяют коагулазу, способствующую образованию «пробки» (чумной блок), препятствующей поступ­лению крови в ее организм. Попытки голодного насекомого к кровососанию сопровождаются срыгиванием зараженных масс на поверхность кожи в месте укуса. В жилищах человека блохи также могут переносить заболевание от человека к человеку (рис. 15).

Рисунок 15. Природные резервуары чумы и пути заражения человека

Природные очаги прочно связаны с определенными ландшафтно-климатическими условиями, всем им свойственна определенная засушливость климата, приводящая к развитию биоценозов, характерных для пустынь, полупустынь, степей, саванн и высокогорных лугов. В РФ природные очаги чумы существуют в 14 регионах: на юге Горного Алтая, Туве и Забайкалье, отдельные случаи отмечают в междуречье Волги и Урала, Ставрополья, Прикаспия и на Кавказе. Всемирное распростране­ние заболевания охватывает практически всю Африку, Азию (особенно Юго-Запад) и Южную Америку; в США заболевание зарегистрировано в 15 штатах, а районы к западу от реки Миссисипи считают эндемичными.

Бактерию Y. enterocolitica впервые выделили Шляйфштайн и Колмэн (1939, типировав ее как атипичного возбудителя псевдотуберкулеза. С середины 60-х годов появились сообщения о выделении данного микроорганизма от больных людей. Основное поражение, вызываемое Y. enterocolitica, —кишечный иерсиниоз — инфекция, сопровож­дающаяся диареей, энтеритом, псевдоаппендицитом, илеитом, узловатой эритемой и (иног­да) септицемией или острым артритом. Ведущий симптом заболевания — гастроэнтерит. Возбудитель широко распространен в природе, его выделяют от насекомых, моллюсков, ракообразных, птиц, грызунов, собак, кошек, домашних сельскохозяйственных животных (основные хозяева). Y. enterocolitica можно также обнаружить в воде многих рек и озер. Инфицирование человека происходит, вероятно, фекально-оральным путем. Большую забо­леваемость регистрируют в странах с теплым климатом. Точные значения распространенно­сти кишечного иерсиниоза до сих пор не установлены, т.к. высеваемость возбудителя из фекалий при гастроэнтеритах не превышает 0-3%. Подъем заболеваемости отмечают в осенне-зимний сезон. В Европе основной резервуар — свиньи, большинство достоверных случаев зараже­ния связаны с употреблением недостаточно термически обработанной свинины. Большин­ство случаев, зарегистрированных в Японии, связано с употреблением в пищу рыбы и рако­образных. Среди возбудителей доминирует серотип O3; в Новом Свете до начала 80-х гг. преобладали поражения, вызванные серотипом O8, но в настоящее время отмечают преоб­ладание серотипа O3.

Септицемии обычно регистрируют у лиц с иммунодефицитами, анемиями, нарушениями обмена железа, заболеваниями почек.

Сравнительно редкие осложнения — фарингиты, поражения сердца и печени.

Возбудитель псевдотуберкулеза впервые выделили Малласе и Виньяль (1883), а по­зднее детально изучили Эберт (1886) и Пфайффер (1886). Y.pseudotuberculosis вызывает у человека острый брыжеечный аденит или аппендицитоподобный синдром с патологоанатомическими изменениями, сходными с таковыми при туберкулезе; у диких и домаш­них животных заболевание протекает с системными поражениями. По-видимому, заражение человека Y. pseudotuberculosis происходит от инфицированного животного путем, общим для большинства кишечных инфекций. Природный резервуар возбудителя — грызуны, олени, домашние животные и птицы. Заболевания человека наблюдают сравнительно редко. Большая часть случаев зарегистрирована в Европе у подростков; пик заболеваемости — зимние месяцы.

Патогенез

Y. pestis внедряется в организм в месте укуса блохи; в свою очередь блохи инфицируются бактериями, питаясь кровью грызунов в период бактериемии, предшествующей гибели жи­вотных (трансовариальная передача возбудителя у блох отсутствует, бактерии погибают при попадании в кишечник личинок). При температуре 28°С (температура тела блохи) Y. pestis не образует фракцию 1 и V/W-Aг. В организме человека возбудитель болезни мигрирует по лимфатическим сосудам в региональные лимфоузлы, где захватывается мононуклеарными клетками. Так как внутриклеточный фагоцитарный киллинг подавляется возбудителем, то начинается его внутриклеточное размножения с развитием воспалительной реакции в лимфоузлах. Размножение бактерий в макрофагах лимфоузлов приводит к увеличению последних, слиянию, образованию конгломератов (бубонная форма). На данном этапе бактерии также резистентны к фагоцитозу полиморфно-ядерными лейкоцитами благодаря Fl и из-за нехватки специфических антител. Поэтому-то затем развивается геморрагический некроз лимфоузлов, бактерии получают возможность прорваться в кроветок и внедриться во внутренние органы, что приводит к септической форме.

Возможна легочная форма поражения, при воздушно-капельном пути распространения.

В результате распада микроорганизмов образуются эндотоксины, обуславливающие интоксикацию.

Y. enterocolitica вызывает энтероколит с диареей, лихорадкой и болями в животе. Факторами вирулентности считают адгезины и инвазины, облегчающие взаимодействие с кишеч­ным эпителием, низкомолекулярные протеины, ингибирующие активность бактерицид­ных факторов и энтеротоксин, аналогичный термостабильным токсинам Е. coli. Бактерии проникают в слизистую оболочку тонкой кишки, размножаются в пейеровых бляшках и мигрируют в брыжеечные лимфатические узлы. Вирулентность бакте­рий существенно повышается в присутствии Fe²⁺. Основной защитный барьер организма, скорее всего, — кислая среда желудка.