Работа №30 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови методом конечной точки по Бессею, Лоури, Броку

Принцип метода. Метод основывается на учете количества образовавшего­ся в результате ферментативного расщепления р-нитрофенилфосфата р-нит­рофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Интенсивность окраски фотометрируемого раствора пропорциональна активности фермента

Реактивы

1. Раствор р-нитрофенилфосфата натрия (субстрата) в 0,001 н растворе со­ляной кислоты, 4 г/л, рН 6,5—8,0.

2. Буферный раствор. 0,05 моль/л вероналового буфера (рН 10,5), в кото­рый вносят хлористый магний (95 мг/л).

Реактив хра­нят в холодильнике.

3. Субстратно-буферный раствор для исследования активности щелочной фосфатазы.

4. 0,02 н раствор едкого натра. Готовят на дистиллированной воде, освобож­денной от углекислого газа путем предварительного кипячения.

5. Стандартный раствор р-нитрофенола — 5 • 10 моль/л.

Ход определения. В предназначенные для постановки опытных и контроль­ных проб пробирки вносят по 0,5 мл субстратно-буферного раствора, содержи­мое их прогревают при температуре 37° С в течение 5 мин; затем в опытные пробы добавляют по 0,05 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (лучше на водяной бане). После инкубации в каждую из пробирок интенсивной струёй вносят 5 мл раствора гидроксида натрия, а в контрольные пробы — по 0,05 мл сыворотки крови. Содержимое пробирок перемешивают и фотометрируют в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 415 нм (400-420 нм - фиолетовый светофильтр). Полученные результаты сравнивают с соответствующими данными контрольных проб, выполняемых для каждой исследуемой сыворотки крови (прежде всего, чтобы учесть мешающее определению влияние билирубина).

Находят разность абсорбции опытной и контрольной проб и по калибровочной кривой (либо выводимому из нее фактору) оценивают активность фермента в размерности «ммоль/ч • л)». Выраженная в единицах Бессея активность щелочной фосфатазы численно равна количеству ммоль р-нитрофенола, которое выделилось бы в процессе часовой реакции (37°С) при взаимодействии субстрата с 1 л сыворотки крови.

Расчет активности щелочной фосфатазы в сыворотке (плазме) крови осуществляют по калибровочной кривой. Данные к ее построению приведены в таблице.

Для построения калибровочной кривой нужно 1, 2, 3, 5 и 7 мл рабочего стан­дартного раствора, содержащего соответственно 0,05, 0,10, 0,15, 0,25 и 0,35 мкмоль р-нитрофенола, довести 0,02 н раствором NaOH до объема 11,1 мл (табл.1) и измерить оптическую плотность смеси с учетом абсорбции, приходящейся на 0,02 н раствор NaOH, использующийся в качестве контрольной пробы. Стро­ят градуировочную кривую, откладывая на оси ординат значения абсорбции, а на оси абсцисс — активность фермента в ммоль р-нитрофенола/(ч • л).

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови практически здоровых взрослых людей составляет 0,5—1,3 ммоль/(ч • л), или 0,5—1,3 ед Бессея—Лоу-ри—Брока. У детей в возрасте до 12 лет она в 1,5 раза выше.

Таблица 1

Данные к построению градуировочного графика для определения активности щелочной фосфатазы

Номер пробирок	Стандартный раствор р-нитрофено­ла, мл	Содержание р-нитрофенола в пробе, мкмоль	Раствор NaOH 0,02 н, мл	Активность фермента в единицах Бессея, Лоури. Брока, ммоль/(ч • л)
	1,0 2,0 3,0 5,0 7,0	0,05 0,10 0,15 0,25 0,35	10,1 9,1 8,1 6,1 4,1

Примечания.

1. Сыворотка не должна быть гемолизирована.

2. Щелочная фосфатаза плазмы (сыворотки) крови термостабильна, по­этому сыворотка может храниться при комнатной температуре в тече­ние нескольких суток.

3. Ложное повышение активности фермента наблюдается при хранении сыворотки в холодильнике в течение 12—24 ч, а также после внутривен­ного введения плацентарного альбумина.

4. У практически здоровых людей, имеющих группу крови В и О, уровень ак­тивности щелочной фосфатазы повышается после приема жирной пищи.

5. Кровь для определения активности щелочной фосфатазы следует брать у обследуемого через несколько суток после приема сульфаниламидных препаратов и антибиотиков.

6. Определение желательно провести не позднее чем через 6 ч хранения об­разца при комнатной температуре и 5 сут хранения в холодильнике (2-8°С). По мере согревания охлажденных проб биологической жидкос­ти активность ЩФ в них непрерывно повышается.

7. Исследование активности кислой фосфатазы (общей и простатической) может быть выполнено также в секрете простаты и эякуляте. До прове­дения исследования биологические жидкости сохраняют в холодильни­ке при 4°С и центрифугируют в условиях охлаждения на обычной цент­рифуге (типа ОПН-3) при 3000 об/мин в течение 20 мин. Ввиду высокой активности фермента в секрете или эякуляте надосадочную жидкость разводят цитратным буфером в 1000 раз.

Для одновременного определения активности щелочной и кислой фосфатаз сыворотки (плазмы) крови двухточечным методом, доступным к использо­ванию в лабораториях, оснащенных ординарной фотометрической аппарату­рой, можно применять метод Бодански.

Способ выражения активности фосфатаз (в ед Бодански) является устаревшим. В соответствии с требованиями используемой в клиниколабораторной практике Международной системы единиц активность эт ферментов следует оценивать по количеству выделенного неорганическ фосфора (в ммоль) при действии на субстрат 1 л сыворотки за время инкУ ции 1 ч при +37°С. Пересчет производится по формуле:

а * 474,19.

В норме активность щелочной фосфатазы составляет у взрослых 0,05-1,3 ммоль/(ч • л), кислой фосфатазы - 0,05-0,13 ммоль/(ч • л).

Примечание: не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 ч после массажа простаты или ее инструментального исследования.