Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии

Кроме описанного «хромового» теста, существуют методики оценки клеточной цитотоксичности с использованием проточного цитофлуориметра. В данном случае для мечения клеток используют два реагента. Сначала метят КМ флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого флуорохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ - одноцветными по первому флуорохрому.

Известен метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности с использованием в качестве КМ эритроцитов (например, барана), покрытых IgG- антителами к ним. КЭ, несущие Fc-рецепторы к IgG, разрушают (лизируют) КМ, и по уровню освобождаемого в культуральную среду гемоглобина судят об активности таких киллеров (NK, В-клетки, моноциты, макрофаги и др.).

Определение перфорина методом ELISPOT

Белок перфорин является необходимым компонентом лизиса, осуществляемого ЦТЛ и NK-клетками для уничтожения КМ. Метод ELISPOT (см. гл. 4) широко применяется для определения выработки цитокинов антигенспецифическими Т-клетками. Метод ELISPOT достаточно чувствителен для выявления перфорина после активации ЦТЛ соответствующими антигенными эпитопами, например вирусными (потенциально годен для использования любой эпитоп). При выполнении данного метода на дне лунки пластикового планшета фиксируются монАТ к перфорину. Недостаток метода - отсутствие возможности определить фенотип клеток, секретирующей перфорин, что частично компенсируется обогащением фракции ЦТЛ магнитной сепарацией. В экспериментах с использованием иммуномагнитной сепарации показано: основную популяцию клеток, образующих «пятна», составляют CD8+

Т-лимфоциты (80-90%).

Связывание с тетрамерными структурами MHC класса I

Конструирование тетрамерных комплексов MHC класса I обеспечило создание быстрого, специфичного и высокочувствительного метода выявления и подсчета антигенспецифических CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Тетрамер состоит из молекул MHC класса I, нагруженных специфическим антигенным пептидом, связанных с биотином, которые затем прикрепляются к стрептавидину, меченному флуорохромом - ФИТЦ, ФЭ и др. (рис. 3.1, см. также цв. вклейку). Тетрамеры MHC класса I связываются с CD8⁺ субпопуляцией Т-лимфоцитов. Созданы тетрамеры MHC класса II, связывающиеся с CD4⁺ Т-лимфоцитами. Тетрамерные структуры характеризуются сниженной способностью связывания с молекулой CD8. Однако сохраняют способность специфически связываться с TКР, обеспечивая точное узнавание антигенспецифических Т-клеток. Количество выявляемых данным методом антигенспецифических клеток составляет менее 1% от всех CD8⁺-клеток.

Отдельное использование тетрамерного связывания не дает информации о фенотипе клеток или функции ЦТЛ, поэтому целесообразно параллельно проводить определение внутриклеточного содержания цитокинов, хемокинов и цитотоксических эффекторных молекул (перфорина, гранзимов), фенотипа специфических CD8⁺ Т-лимфоцитов.

Рис. 3.1.Тетрамерные структуры: а - строение тетрамерной структуры; б - связывание тетрамера ЦТЛ; в - пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ - фикоэритрин

Использование методов цитофлуориметрического определения цитотоксической активности в комбинации с тетрамерным методом и иммунофенотипированием позволяет полно охарактеризовать популяции КЭ (ЦТЛ) и КМ. Данные методы - мощный инструмент для изучения кинетики киллерной активности ЦТЛ, они дают представление о фенотипе клеток и позволяют отслеживать физиологические изменения в КЭ и КМ