Тақырып. ДНК денатурациясы

1. Денатурация процессінің кооперативтілігі. Балқу температурасы. Гиперхром эффектісі.

2. Денатурацияны бағалау тәсілдері.

3. Ренатурация және нуклеин қышқылдарының молекулалық гибридизациясы

4. ДНК-РНК гибридизациясы. Молекулалық гибридизация тәсілімен ДНҚ нуклеотидтер қатарының ұқсастығын анықтау.

1. Денатурации процессінің кооперативтілігі. Балқу температурасы.Белоктар тәрізді нуклеин қышқылдары денатурацияға қабілетті. Бұл процесс ДНҚ қос тізбектерінің және РНҚ қосарланған аймақтарының ажырауы (негізінен тРНҚ) арқылы жүреді. ДНҚ макромолекулалық құрылымының молекула аралық ерекшілігігі, олардың коопереативтілігі. Комплементарлы гомопинуклеотидтерден құралған қос тізбектер үшін, жоғарғы температурада қыздырғанда денатурация жүріп, олар жеке дара тізбектерге ыдырап, спиральдық құрылымның барлық мүшелері бір уақытта бұзылады. Мұндай үдерісті қос спиралдың балқуы деп атайды.

Кез-келген кристалл сияқты ДНҚ балқуы кооперативті түрде іске асады. Комплементарлық матрицада жаңа полинуклеотидтік тізбектің қалыптасуы барысында стэкингілік –өзара әрекеттесу де кооперативті түрде өтетін үдеріс. Мысалы, полиуридилин қышқылдарының екі тізбегінде полиаденилин қышқылдары тізбегінің жасақталуы барысында үш спиралдан тұратын кооперативтік кешеннің түзілуіне әкеліп соғады. Стэкинг-әрекеттесудің пайда болуы спиралдың ұзаруын жаңа спиральдық аймақтардың жаңадан басталып өсуіне қарағанда энергиялық жағынан ұтымды етеді.

Қышқылдар, сілтілер, спирттер немесе ДНҚ молекуласынан кейбір иондарды, мысалы Mg²⁺. бөліп шығару арқылы денатурация тудыруға болады. Денатурация нәтижесінде молекуланың әрбір тізбегі бейберекетсіз шумақ оралым түзеді, сондықтан бұл спиральдың –шумаққа айналуы деп аталады. Нуклеин қышқылдарының жылу арқылы денатурациясы, белоктар сияқты температураның қысқа интервалында өтеді, және ол да кооперативті сипатқа ие болады, бұл үдерістің негізгі сипаты балқу температурасы. Бұл жағдайда, спирал толық шумаққа айналады.

Ультракүлгін сәулелерінің ұзындығы 260 нм толқын ұзындығында жұтылу шамасының температураға тәуелдігі ( нуклеин қышқылдарының жарықты ең нәтижелі жұтатын толқын ұзындығы) балқу қисығы деп аталады ( сурет ). Нативті жағдайда нуклеин қышқылдары жарық сәулесін денатурацияланған күйге қарағанда аз жұтады. Бұл гипохромдық эффект деп аталады, ол нативті молекула құрылымындағы бірінің үстіне бірі тығыз жиналған негіздердің өз-ара стэкинг- әрекеттесуінің негізінде туындайды. Осы уақытта денатурацияға түскен полинуклеотидтің жарықты жұту қабілеті, шамамен оның құрамдас бөліктерінің жарық жұту шамасының қосындысына тең, сол себепті қос тізбекті құрылымда негіздердің бірі үстінде, екінші біреуі астында орналасуына байланысты 260 нм. толқындық ұзындықта жарықтың жұтылуы 34% төмендейді. Бұл құбылыс полинуклеотидтерді оптикалық жолмен зерттеудің негізін қалайды. Дуплекстегі ( ДНҚ қос спиралі) негіздердің өз-ара әрекеттесуі комплементарлық жұптардың құрамы мен олардың қатарларына байланысты.

На Полинуклеотидтер ертіндісінде, мұндай әсерлесудің болуы, онымен құрамы сәйкес келетін мономерлер қосындысының физикалық-химиялық қасиеттерімен салыстырғанда айырмашылығы болатындығын көрсетеді. Полинуклеотидтердің молярлық экстинция коэффициенті ( УК-сәуленің жұтылуы) оның құрамына кіретін мономерлердің молярлық экстинция коэфициентінің қосынды шамаларынан аз болады. Балқу температурасы Т_пл- - бұл сәулені жұту қабілетінің максималдық деңгейдің жарты мәнін құрайтын нүкте. Нуклеин қышқылдары құрамындағы GC-мөлшері көбейген сайын ол денатурацияға тұрақты болады, бұл жерде Т_пл GС-мөлшеріне тәуелділігі түзу бағытта. Для раствора, содержащего рН 7,0 тең, құрамы, 0,15 М NaCl + 0,015 М натрий цитратынан тұратын ертіндіде оның мөлшері төмендегі теңдеумен өрнектеледі.

GC-мөлшері (%) = 2,44 (Т_пл – 69,3)^оС.

ДНҚ-дағы GС-мөлшері мен Т_пл ара қатынасы ортаның рН және оның иондық құрамына өте тәуелді болады.

ДНҚ молекуласының толық денатурациясы комплементарлы тізбектердің толық ыдырауына әкеліп соғады. Тез салқындатқанда денатурацияланған ДНҚ тізбектері осындай ажыраған күйде ұзақ қалып отырады. Бірақта, егер белгілі уақыт ішінде температураны балқу шамасынан төмен ұстасақ ( бұл үдеріс қабысу деп аталады) ДНҚ нативті құрылымы қалпына келеді. Гибридтік дуплекстер түзілуіне негізделген мұндай әрекеттер нуклеин қышқылдарын зерттеудің маңызды тәсілдерінің пайда болуына себеп болды.

2. Денатурацияны зерттеу тәсілдері.ДНҚ –ныңнативтікүйінен денатурациялық күйге өтуін және басқа да қасиеттерін бағалау мақсатында бірнеше тәсілдер қолданлады:

1. УК –аймағындағы жұтылу Барлық нуклеин қышқылдарының максималды жұтылуы 260 нм. толқын ұзындығында жүреді. ДНҚ нативтілігі бұзылса, үлкен гиперхромды әсер байқалады-жұтылу өседі. Бұндай өзгерістердің болуы сутектік байланыстардың санымен анықталады, ол ДНҚ, РНҚ және синтетикалық полинуклеотидтерге тән, себебі олардың құрылымы сутекті байланыстар арқылы құралған.

2. Оптикалық айналыс. Нативті ДНҚ полярланған жарық кеңістігінде оң айналыс жасайды, ол денатурация жағдайында азаяды.

3. Тұтқырлығы. Нативті ДНҚ ертіндісі жоғарғы тұтқырлық көрсетеді, ол ондағы қатты қос спиральды және жазылған стерженьтәрізді құрылымға байланысты. Сутектік байланыстардың үзілісі жүргенде ертінді тұтқырлығы төмендейді

4. Темпреатураның әсері. Жоғарыда атап өткендей, ДНҚ нұсқасын белгілі иондық ортада қыздырғанда УК-аймақта жұтылу қабілеті артып, оптикалық айналу мен тұтқырлық қабілеті төмендейді, қос спиралдық жіпшелердің арасындағы сутектік байланыстардың жойылуын көрсетеді.Екі тізбек арасындағы негіздер арасындағы әсерлесу кристалдағы молекулалардың бір-бірімен әсерлесуі сияқты кооперативті болғандықтан, түзетілген спиральдық құрылым красталдың балқуы сияқты, азғантай температура аралығында өтеді. Сол себепті қостізбеті ДНҚ денатурациясын ДНҚ « балқуы» деп атаса, осы кезде ДНҚ 50 % - балқыйтын температураны балқу температурасы - Т_пл. деп атайды.

Препараты ДНК из разных источников имеют различные Т_пл, которые зависят от абсолютных количеств G+С и А+Т. Чем выше содержание G+С, тем выше температура перехода между нативной двойной спиралью и одноцепочечной формой. Это можно объяснить тем, что пары G-С могут образовывать структуру с помощью трех водородных связей, в то время как пары А-Т могут образовать только две водородные связи. Определение значений Т_пл при использовании для калибровки препаратов ДНК с известным составом позволяет вычислить содержание G+С и А+Т неизвестной ДНК. Такое определение следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК. Значение Т_пл можно снизить, добавляя мочевину — реагент, разрушающий водородные связи и препятствующий гидрофобным взаимодействиям. Например, в 8 М мочевине Т_пл снижается ~20°С. В 95%-ном формамиде ДНК полностью разделяется на две нити при комнатной температуре.

5. Влияние рН. Двуспиральная структура ДНК разрушается также при кислых и щелочных значениях рН, при которых на пуриновых и пиримидиновых основаниях могут появляться заряженные группировки. Вблизи рН 12 ионизация енольных гидроксидных групп предотвращает связывание кето- и аминогрупп за счет водородных связей. Аналогично в кислых растворах вблизи рН 2—3, при которых протонируются аминогруппы, спираль разрушается.

3. Ренатурация и молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Денатурация ДНК—процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурирована, например при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая ренатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоциировать медленно («отжиг» ДНК). Этот процесс включает две стадии: сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплементарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка — быстрое их «защелкивание». Если начальная концентрация денатурированной ДНИ С_о (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка dc/dt = К₂С², интегральная форма которого С(С_о=1/(1+К₂С_оt). Скорость ренатурации обычно оценивается по графику зависимости С/С_o от lgС_ot (рис.). Построив график, можно найти С_оt_1/2, где t_1/2 — время, при котором С/С_o= 0,5, а также константу скорости реакции второго порядка К₂, равную

Константа К₂ — характеристический параметр для данной ДНК; она обратно пропорциональна N — числу пар оснований ДНК (если ДНК не имеет повторяющихся последовательностей). С_оt_1/2 прямо пропорционально N (N называется сложностью ДНК). Этот метод позволяет определить для бактериальных и вирусных ДНК значения N, согласующиеся со значениями, полученными другими методами.

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных

спиралей (ионная сила раствора — около 0,2; температура на 10-20 °С ниже Т_пл нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязавшейся ДНК. Этот же подход используется про выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. Скорость процесса ренатурации ДН обычно описывают уравнением

где С - концентрация однотяжевой ДНК; С_о - суммарная концентрация ДНК; t — время; k - константа скорости второго порядка. Из этого уравнения видно, что доля денатурированной ДНК, еще не реассоциированной к моменту времени t, есть функция С_оt. Поэтому важнейшей характеристикой процесса ренатурации ДНК является величина С_оt_1/2, при которой реассоциация проходит на 50 %.

4. ДНК-РНК гибридизация. Установление сходства нуклеотидной последовательности цепей ДНК путем молекулярной гибридизации.Метод молекулярной гибридизации основан на способности азотистых оснований образовывать комплементарные пары: А-Т и G-С. Реакция гибридизации используется в генетической инженерии для создания гибридных молекул ДНК, а также как весьма чувствительный метод выявления определенных последовательностей в ДНК и РНК. Если после процесса денатурации две изолированные цепи ДНК выдерживать определенное время при 65°С, то они вновь спариваются, образуя двойную спираль, — что и называют ренатурацией, или гибридизацией (отжигом). Гибридизация может идти между одинарными цепями ДНК и/или РНК (конечно, если они имеют комплементарные последовательности нуклеотидов). что приводит к образованию двойных цепей (дуплексов) разного состава: ДНК: ДНК; РНК: РНК; ДНК: РНК.

При конструировании гибридных ДНК гибридизация нуклеиновых кислот реализуется, как правило, в двух основных стратегиях (методах) получения рекомбинантных ДНК: коннекторном и рестриктазно-лигазном.

Коннекторный метод создает условия для гибридизации продуктов рестрикции разных геномов путем наращивания на их концах комплементарных олигонуклеотидных участков. Гибридизация (отжиг) этих фрагментов ведет к образованию гибридных молекул ДНК. В этом методе используются 3 фермента: 5’- экзонуклеаза, терминальная нуклеотидилтрансфераза и ДНК-лигаза. Именно этим методом П. Берг и сотрудники получили в 1972 г. первую гибридную молекулу ДНК.

Рестриктазно-лигазный метод, разработанный Коэном и сотрудниками в 1973 г., наиболее прост и популярен в генетической инженерии. В этом методе с использованием одной рестриктазы типа II, дающей фрагменты рестрикции с «липкими концами», гибридизация между фрагментами хромосомной ДНК и ДНК-плазмидой осуществляется без дополнительной процедуры наращивания комплементарных концов. После окончания гибридизации остается только сшить полинуклеотидные фрагменты с помощью ДНК-лигазы.

Одним из типов двойных спиралей, которые получают искусственным путем, является гибрид ДНК — РНК. Оказалось, что молекулы информационной (матричной) РНК (мРНК) гибридизуются только с одной из двух разделившихся цепей ДНИ, несущей участки, комплементарные мРНК. Метод гибридизации используется также для получения гетеродуплексов ДНК, в которых две цепи молекулы происходят от двух разных генетических линий одного и того же вида организмов. Известно, что некоторые мутации состоят в делеции (выпадении) или вставке одного или нескольких оснований в цепь ДНК. Гетеродуплексы, в которых одна из цепей нативная, а другая - со вставкой или делецией, имеют по всей своей длине нормальную структуру по Уотсону-Крику, за исключением тех участков, где делеции или вставки нарушают комплементарность и образуются одноцепочечные петли. Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель или наносят на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе «партнеров», свободно проходят дальше.

4. Нуклеин қышқылдарының денатурациясы ,ренетурациясы және молекулалық гибридизациясы.Қосарланған спиралды тұрақтандыратын сутектік байланыстар мен азоттық негіздер кеңістігі арасындағы өз-ара әрекеттесулер өте әлсіз болып табылады, температураны ( 100 °С дейін ) көтергенде тізбектердің ажырауы өтеді. Мұндай процессті қосарланған спиралдың балқуы немесе денатурациясы деп атайды. Бұл жерде А-Т-жұбы арасындағы екі сутектік байланысты ажыратуға G-С-жұбының арасындағы үш сутектік байланысты ажыратуға қарағанда аз энергия жұмсалады, сондықтан молекуланың денатурациясы өтетін температура ДНҚ нуклеотидтік құрамына байланысты. ДНҚ денатурациясы оған түрлі химиялық заттар, мысалы сілтімен әсерлескенде өтуі мүмкін. Егер ДНҚ судағы ертіндісін 96— 100°С температураға дейін қыздырса немесе күшті сілтімен (рН> 13,0), әсер еткізсе, онда ДНҚ жеке тізбектерге ыдырап диссоцияланады. Денатурация — бұл қайтымды процесс. ДНҚ қос тізбекті құрылымының қайта қалпына келуі олар жеке тізбектерге толық ыдырағанда да іске асады. Тізбектердің қайта қосылу процессін ренатурация, реассоциация немесе отжиг деп атайды, ол температура төмендегенде комплементарлық негіздердің өз-ара әрекеттесуі арқылы жүреді.

Молекулярлық гибридизация тәсілі азоттық негіздердің комплементарлы жұптар: А-Т және G-С түзуіне негізделген. Гибридизация реакциясы гендік инженерияда гибридтік ДНҚ молекуласын жасақтауға, және сонымен қатар ДНҚ мен РНҚ белгілі нуклеотидтер қатарын анықтайтын сезімтал тәсіл ретінде қолданылады.. Егерде денатурация процесінен кейін екі оқшауланған ДНҚ тізбектерін 65°С температурада белгілі уақытқа ұстаса, онда олар қайта бірігіп қосарланған спираль түзеді, оны ренатурация , немесе гибридизация ( отжиг) деп атайды. Гибридизация құбылысы ДНҚ –ның ажыраған жалаң тізбектерінің арасында, РНҚ жалаң тізбектерінің ( егер олар комплементарлы нуклеотидтер қатарынан құралған болса), ДНҚ мен РНҚ тізбектерінің арасында, әртүрлі құрамдағы қосарланған тізбектердің ( дуплекстер) түзеді: ДНК: ДНК; РНК: РНК; ДНК: РНК.

Гибридтік ДНҚ молекуласын құрастырғанда нуклеин қышқылдарының гибридизациясы рекомбинанттық ДНҚ алудың екі негізгі стратегиясына (тәсіл) негізделген: коннектортор және рестриктаза-лигаза ферменттерінің қызметтері арқылы.

Коннекторлық тәсілді қолдану кезінде, әртүрлі геномдардың рестрикция өнімдерінің ұш жақтарына бір-біріне комплементарлы олигонуклеотид аймақтарын жалғап өсіреді. Бұл фрагменттердің гибридизациялануы (отжиг) ДНҚ молекулаларының гибридтік түрлерінің түзілуіне әкеліп соғады. Бұл тәсілде 3 фермент қолданылады: 5’- экзонуклеаза, терминальдық нуклеотидилтрансфераза және ДНК-лигаза. Осы жол арқылы П. Берг және басқалар 1972 ж. бірінші гибридтік ДНҚ молекуласын алған. Рестриктазалық –лигазалық тәсілді 1973 ж. Коэн және оның қызметкерлері ұсынған. Бұл тәсіл қарапайым және гендік инженерияда кеңінен қолданылады. Бұл тәсілде рестрикция фрагменттерін рестриктазалық ферменттердің II типі «жабысқыш ұшты» қылып кеседі, сондықтан хромосомалық ДНҚ фрагменттері мен плазмидтік ДНҚ-ның фрагменттерінің гибридизациялануы тізбектің комплементарлы ұштарын қосымша жалғау жұмыстарын жүргізбестен іске асады. Гибридизация біткенннен кейін полинуклеотид фрагменттері бір-бірімен ДНҚ-лигаза ферментінің көмегімен біріктіріліп тігіледі

5. Нуклеин қышқылдарының генетикалық қызметінің дәлелденуі.. Түрліғылымизертеулерден белгілі болғандай ДНҚ генетикалық материал ретінде қызмет ететіндігі анық болды.

1. 1928 ж. Ф. Гриффитс пневмококктарда трансформация ( бактерия қасиетінің өзгеруі) өзгеруі құбылысын байқаған. Капсуласы дамыған вирулентті клеткалар тышқандардың өліміне әкеліп соғатын ауырулар тудырады; капсуласы дамымаған авирулентті клеткалар немесе қыздырылып өлтірілген вирулентті штамм клеткалары тышқандарда ауыру тудырмайды Бір уақытта тірі авируентті клеткалар мен қыздырылып өлтірілген вирулентті клеткалар егілген тышқан сырқаттанады және өледі. Вирулентті емес бактерия штамының клеткасы, вирулентті штам клеткасының ( капсула түзетін ) қасиетін қабылдайтындығын Г. Гриффитс көрсете білген. Алынған ғылыми қорытынды бойынша ғалым вируленттік штамның генетикалық материалының бір бөлігі авируленттік штамға ауысып, оны вирулентті бактерия штамына ауыстрады

2. 1944 ж. Америка ғалымдары О.Эвери, К.Мак-Леод және Мак-Карти микроорганизмдер ( пневмококк ) белгілердің трансформациялану тәжірибелерінде нуклеин қышқылдарыынң генетикалық ролін дәләлдеген. Қыздыру арқылы өлтірілген вирулентті ( капсулалы) клеткалардың ДНҚ-сын тірі вирулентті емес ( капсуласы дамымаған) штамм клеткаларының өсірілу ортасына ( культура) қосқан. Бұл ДНҚ тірі клеткаларды трансформациялап, оларды вирулентті формаға айналдырған. Алдын-ала қыздырылып өлтіріліп вируленттік клеткалардан бөлінген басқа заттар мұндай эффект бере алмайды.

3. 1952 ж. А.Херши және М. Чейз ДНҚ-ның генетикалық тұқым қуалаушы ақпарат екендігін вирустарда дәлелдеген.