Рекомендации по подготовке к постановке ПЦР
•Используйте стерильные материалы и только свежие перчатки (или просто чаще мойте руки), когда Вы готовите постановку ПЦР.
•Для подготовки ПЦР и матрицы для ПЦР используйте новые, ни разу неиспользованные, материалы (пластик, наконечники). Никогда не пользуйтесь мытыми и бывшими в употреблении материалами.
•Если реактивами для постановки ПЦР пользуются несколько человек, разделите исходные реактивы по аликвотам для каждого пользователя. Никогда не используйте непроверенные и чужие реактивы.
•При пипетировании старайтесь не создавать аэрозоль, который может привести к контаминации.
•Всегда включайте в эксперимент отрицательный контроль. В качестве отрицательного контроля используйте матрицу, не содержащую гомологичной Вашим праймерам последовательности и/или так называемый “минус ДНК контроль”, где содержатся все компоненты, кроме матрицы.
Стандартная методика для проведения ПЦР
Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным учет результатов реакции при проведении электрофореза.
Методика проведения ПЦР
1. Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.
2. В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях (Табл.1.):
Таблица 1
Соотношение компонентов ПЦР-реакции
| Компонент | Конечная концентрация | Количество компонента на 50 мкл смеси |
| 10х ПЦР-буфер | 1х | 5 мкл |
| 10мМ смесь дНТФ | 0.2 мМ каждого | 1 мкл |
| Праймер 1 (50 мкМ) | 1 мкМ | 1 мкл |
| Праймер 2 (50 мкМ) | 1 мкМ | 1 мкл |
| Taq-ДНК-полимераза | 1.25 ед | 0.5 мкл |
| ДНК-матрица | 0.1 – 1 мкг | Варьирует от концентрации образца |
| Деионизированная вода | - | до 50 мкл |
3. Устанавливается амплификационный цикл в приборе:
Предварительная денатурация, 94°С –4 мин;
Денатурация, 94 °С – 20-60 сек;
Отжиг праймеров, 37-68 °С – 20-60 сек; кол-во циклов
Элонгация, 72°С – 20-60 сек; 20-40
Конечная элонгация при 72 °С – 5-15 мин.
Комментарии к методике:
1. Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации можно опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатурации при 95°C не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНК-матрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение.
2. Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением ПЦР реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образованных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограничение по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких продуктов).
3. Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с реакционной смесью только после проведения первой денатурации.
4. Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси:
a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20°C продолжительное время, при +4°C – несколько суток;
б) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70°C и –20°C продолжительное время, при +4°C – несколько недель.
в) все, кроме матрицы. Хранить при –70°C и –20°C продолжительное время, при +4°C не более суток. Однократное замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq-полимеразы.
5. Если в методике предусмотрено использование масла, то после проведения ПЦР можно избавиться от него следующим способом:
• заморозить на –20°C. Вода замёрзнет, масло – нет;
• можно дополнительно сполоснуть охлаждённым (~4°C) хлороформом.
6. Оптимально проводить ПЦР в объеме реакционной смеси 50 мкл. Можно также проводить ПЦР и в меньших объемах. Для этого необходимо уменьшить в соответствующее число раз приводимые ниже количества. Минимальный рекомендуемый нами объем реакционной смеси - 10 мкл, оптимальный - 25 мкл.
7. От количества праймеров, добавляемых в реакцию, значительно зависит количество получаемого в ходе ПЦР продукта. Подбор оптимального количества праймеров отдельная и очень важная задача. Помните, праймеры весьма чувствительны к эстеразам и нуклеазам, которые могут попасть в растворы праймеров с кожи или при дыхании.
8. Чаще всего в ПЦР используют конечную концентрацию dNTP равную 250 мкМ. Допустимая конечная концентрация dNTP в реакции может быть от 15 до 350 мкМ в зависимости от конкретной задачи и длины получаемого фрагмента.
9. Допустимые количества Taq-полимеразы в реакции - 0.5 - 5 ед/проба. Разницы результата в указанных пределах практически не наблюдается. Меньшие количества могут привести к ухудшению воспроизводимости результатов, большие количества не дают абсолютно никаких преимуществ.
10. Количество ДНК также важно для результативности ПЦР, как и количество праймеров. Недостаток ДНК-матрицы приводит к уменьшению выхода конечного продукта, увеличение ДНК-матрицы в пробе приводит к появлению неспецифических полос. Оптимальное количество ДНК-матрицы в пробе - 25-150 нг.
11. Время, устанавливаемое для каждого этапа ПЦР (денатурация, отжиг, реакция), зависит от используемого прибора для проведения ПЦР. Подбор оптимальных условий, часто дело эмпирическое.
12. Для анализа получаемых фрагментов <1000 п.н. лучше использовать 2%-ый гель. Для фрагментов 1000 – 2000 п.н. - 1.5%-ый гель. Для более длинных фрагментов - 1%-ый или 0.7%-ый гель. Бромистый этидий лучше добавлять в гель при его подготовке, т.к. плотные гели плохо прокрашиваются (если окрашивать гель после электрофореза).
13. При разделении фрагментов в геле с бромистым этидием следует помнить, что подвижность фрагмента зависит от количества интеркалированного в ДНК бромистого этидия и от буфера, в котором этот фрагмент нанесен. То же самое относится и к используемым маркерам.
14. ПЦР продукт может храниться некоторое время, но будет постепенно деградировать, поскольку даже самый высокоочищенный препарат полимеразы всегда содержит микропримеси нуклеаз. Время хранения увеличивается в следующей последовательности: [Ткомн] → [+4°С] → [-20°С] → [-70°С]. Стабильность хранения можно значительно увеличить, обработав образец фенолом, с последующим его переосаждением.
Проблема контаминации
Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода – контаминацией. Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки (выделения ДНК). Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на дУТФ (урацил), и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации. Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации. Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идёт со 100% эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми, что существенно снижает ценность такого подхода. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки. Таким образом, оба эти метода лишь в некоторой степени позволяют устранить источник контаминации и не гарантируют от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Есть третий способ борьбы с результатами контаминации, рассматриваемый скорее как казусный – значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов велик. Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями. В качестве отрицательных контролей рекомендуется использовать воду из комнаты пробоподготовки (после каждого десятого клинического образца желательно обрабатывать вместо биологического образца пробирку с водой). Все реактивы рекомендуется хранить разлитыми на отдельные порции (аликвоты). Если все же, несмотря на принятые меры, обнаружены следы контаминации, то все используемые порции реактивов следует заменить на новые, а все поверхности помещения, оборудования, пипеток и пр. необходимо обработать 0,1 М HCl, либо хлорсодержащими препаратами, например, ДП-2Т, рекомендуемым Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.
Таким образом, несмотря на пользу преамплификационных мероприятий, направленных на инактивацию молекул ДНК, служащих причиной возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, наиболее радикальным средством является заранее тщательно продуманная организация ПЦР-лаборатории.
Возможные проблемы при постановке ПЦР и способы их решения обобщены в приложении (Приложение 2).