Анализ дифференцировки мезенхимных стволовых клеток in vitro

Принцип анализа:

Стволовые клетки функционально определяются своей способностью к самовоспроизведению и генерации большого числа дифференцированных прогениторных клеток, которые в дальнейшем развиваются в специализированные клетки организма. Различные популяции стволовых клеток были выделены из разных тканей взрослого организма, например мезенхимные стволовые клетки (МСК) были выделены из костного мозга. МСК имеют способность дифференцироваться в адипоциты (клетки жировой ткани), хондроциты (клетки хрящевой ткани), остеоциты (клетки костной ткани), гепатоциты ( клетки паренхимы печени), кардиомиоциты (мышечные клетки сердца) и нейроны. Стволовые клетки способны к дифференциации при получении сигнала “извне”. Эти сигналы в любом организме возникают естественным путем, но могут быть созданы искусственно в лабораторных условиях. Известно, что специфическая дифференцировка стволовых клеток может быть индуцирована микроокружением специальных культуральных сред.

В процессе выделения и культивирования МСК их статус лучше всего устанавливается по их способности к дифференцировке в разные мезенхимные клеточные линии, – именно эта способность и определяется с помощью анализа дифференцировки. R&D Systems' Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (специальная тест система, созданная для проведения данного анализа in vitro) содержит специальные добавки в питательную среду, которые позволяют индуцировать дифференцировку МСК в адипо-, остео- и хондроциты, а также набор антител для определения фенотипов зрелых клеток.

Материалы, входящие в набор для анализа:

- адипогенная добавка в питательную среду

- остеогенная добавка в питательную среду

- хондрогенная добавка в питательную среду

- ITS добавка, содержащая инсулин, трансферрин, альбумин и линолевую кислоту

- лиофилизированные козлиные поликлональные антитела к белку FABP4 (белок-переносчик жирных кислот, специфичен для адипоцитов)

- лиофилизированные мышиные поликлональные антитела к остеокальцину (маркер формирования кости)

- лиофилизированные козлиные поликлональные антитела к аггрекану (протеогликан клеток хрящевой ткани)

Материалы:

-мезенхимные стволовые клетки человека

-24-луночные культуральные планшеты

- круглые покровные стекла (12 мм)

- 15 мл пробирки для центрифугирования

- микропипетки переменного объема

-хирургические щипцы

Реагенты:

-питательная среда αMEM

- питательная среда D-MEM/F-12

- сыворотка плодов коров

- фосфатно-буферный раствор (ФБР)

- пенициллин

- стрептомицин

- глутамин

- 4% раствор параформальдегида в ФБР

- 1% раствор альбумина в ФБР

- раствор, содержащий 0,3 % TritonX-100, 1% альбумина, 10% сыворотки в ФБР

- гистологическая среда

-вторичное антитело, конъюгированное с флюорофором

-дистиллированная вода

Оборудование:

- термостат ( 37 ° C, 5% CO₂)

- центрифуга

-флуоресцентный микроскоп

- водяная баня

- криостат

Схема анализа:

Состав питательных сред.

	ОСНОВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА	СПЕЦИАЛЬНАЯ ДОБАВКА
Адипоциты	αMEM 90% Сыворотка плодов коровы 10% Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин	гидрокортизон изобутилметилксантин индометацин
Остеоциты	αMEM 90% Сыворотка плодов коровы 10% Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин	дексаметазон аскорбат-фосфат бета-глицеролфосфат
Хондроциты	D-MEM/F-12 99% ITS добавка 1 % Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин	дексаметазон аскорбат-фосфат пролин пируват