Определение активности дезоксирибонуклеазы

Принцип методаПри действии дезоксирибонуклеазы на ДНК образуются кислотные группы, которые обесцвечивают индикатор феноловый красный,

Реактивы:1) раствор NаСI — 0,14 моль/л; 2) субстратный раствор (1мл— 2 мг раствора натриевой соли ДНК), 1 мл раствора сульфата натрия (0,05 моль/л) и 0,4 мл раствора фенолового красного (10 мг фенол-сульфофталеина, 0,28 мл 0,1 М раствора NaОН, 3 мл 96% этанола, 40 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,55). Смесь заливают водой до объема 100 мл, рН субстратного раствора (2,4 мл) доводят до 7,55, добавляя 0,01 н. раствор NaОН, и доливают водой до 3 мл.

Ход работыВ 10 мл охлажденного раствора МаС1 растирают 15 мг ткани. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 10 000 об/мин. К 3 мл субстратного раствора прибавляют 1 мл полученной надосадочной жидкости ферментного раствора. Смесь помещают в кювету спектрофотометра. Измеряют оптическую плотность при 558 нм (зеленый светофильтр) в течение 10-15 мин с интервалом в минуту. Активность фермента оценивают графически. По оси абсцисс откладывают время в минутах, а по оси ординат — значения оптической плотности. Активность фермента выражают снижением оптической плотности комплекса ДНК и красителя, разрушающегося в результате гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты за первые 3 мин инкубации.

Результат: ______________________________________________________

__________

Вывод______________________________________________________________

__________

XII.ТЕМА БИОХИМИЯ

Бензидиновая проба на кровь

Принцип методаГемоглобин обладает способностью катализировать окисление бензидина перекисью водорода, Образующиеся при этом продукты окисления бензидина имеют синюю или зеленую окраску. Реакция очень чувствительна'и служит для обнаружения небольших количеств крови в биологических жидкостях.

Реактивы:

1) раствор бензидина — 50 г/л (в ледяной уксусной кислоте, свежеприготовленной); 2) раствор перекиси водорода — 30 г/л; 3) дефибринированная кровь, разведенная водой.

Ход работы: В пробирку наливают 5 капель разведенной дефибринированной крови и такое же количество бензидина, затем добавляют 5 капель раствора перекиси водорода. Появляется синее или зеленое окрашивание.

Результат: ______________________________________________________

__________

Вывод______________________________________________________________

________________________

Получение кристаллов гемина из гемоглобина (проба Тейхмана)

Принцип методаПри нагревании крови с ледяной уксусной кислотой гемоглобин распадается на гем и глобин. Если гидролиз крови проводить в присутствии уксусной кислоты, содержащей галогеновые соли, гем превращается в солянокислую соль — гемин, образующий характерные кристаллы ромбовидной формы. Проба Тейхмана используется в судебно-медицинской практике для доказательства наличия кровяных пятен.

Реактивы, исследуемый материал:

1) ледяная уксусная кислота, содержащая галогеновые соли; 2) кровь.

Ход работы

Стеклянной палочкой наносят на предметное стекло каплю крови, размазывая ее по стеклу. Полученный мазок не должен быть очень тонким, однако и не слишком толстым. Мазок сушат, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки (если стекло с кровью держать над самим пламенем или внести в пламя, опыт не удастся). На высохший мазок наносят 2 капли уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до закипания жидкости под стеклом (не.кипятить!). После этого вводят под стекло еще 2 капли уксусной кислоты и рассматривают препарат под микроскопом.

Кристаллы гемина под микроскопом имеют вид ромбовидных палочек, окрашенных в бурый цвет. Кристаллы гемина зарисовывают в тетради.

Результат: ______________________________________________________

__________

Вывод______________________________________________________________

________________________

ВИЗУАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

Реактивы: АДФ (0,2 мг/мл) в изотоническом растворе; силиконизированные пипетки на 0,2 мл; пробирки; секундомер.

Ход работы: в пробирку с 0,2 мл плазмы добавляют 0,1 мл раствора АДФ и включают секундомер. Перемешивают. При появлении агрегатов (крупинки) секундомер останавливают. Проводится реакция при комнатной температуре. У здоровых людей образование агрегатов начинается через 17—20 с.

Результат: ______________________________________________________

__________

Вывод______________________________________________________________

__________