Для электронной микроскопии
1. Быстрое взятие кусочков размером 0,5-1,0 мм3.
2. Фиксация в 3,5% буферном растворе глютаральдегида — 1 ч.
3. Промывание в буферных растворах (рН 7,3-7,4) — 3 раза по 5 мин.
4. Фиксация (постфиксация) в растворах, содержащих четырехокись осмия — 1-2 ч.
5. Промывание в буферных растворах — 3 раза по 5 мин.
6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации — 50°, 60°, 70°, 90°, 100° (по 15 мин в каждом).
7. Пропитывание эпоксидными смолами — 24 ч.
8. Заливка эпоксидными смолами (эпон, аралдит) с добавлением катализатора, ускоряющего полимеризацию смол, и помещение в термостат с температурой 58° — 2 сут.
9. Приготовление полутонких срезов толщиной 1-2мкм и окраска их метиленовым синим.
10. Приготовление ультратонких срезов толщиной 400-800 нм, перенесение их на сеточки.
11. Окрашивание (контрастирование) ультратонких срезов на сеточках уранилацетатом (10 мин), а затем цитратом свинца (10 мин).
Цель занятия — ознакомление с принципами гистологических и гистохимических методов.
Задачи:
1. Овладеть основными методиками приготовления фиксированных и окрашенных препаратов клеток, тканей и органов для световой микроскопии и работой на микротоме.
2. Овладеть некоторыми цито- и гистохимическими методами исследования.
3. Ознакомиться с методами прижизненного изучения клеток и тканей.
Необходимый исходный уровень знаний:
1. Понятие о видах гистологических препаратов.
2. Требования к гистологическому препарату для микроско-пирования в световых и электронных микроскопах.
3. Понятие о цито- и гистохимических методах исследования.
Задания:
1. Залить в парафин материал, проведенный ранее, до второго парафина (схема 1).
2. Изучить конструкцию санного микротома и овладеть методами приготовления парафиновых срезов и получения замороженных срезов в криостате.
3. Пользуясь сведениями, приведенными в схеме 2, окрасить парафиновый срез гематоксилин-эозином. Обратить внимание на то, что гематоксилин (основной краситель), окрашивает ядра в фиолетовый цвет, а эозин (кислый краситель) — цитоплазму клеток в розовый цвет.
4. Пользуясь указаниями схем 4 и 5, окрасить срезы акридином оранжевым и метиловым зеленым-пиронином.
5. Приготовить препарат свежей крови и исследовать в фазово-контрастном микроскопе.
6. Овладеть методом суправитального окрашивания мазков крови с помощью красителя бриллианткрезилового синего, позволяющим выявлять ретикулоциты (молодые эритроциты). Обратить внимание на окрашивание структуры ретикулоцитов в синий цвет.
7. Ознакомиться с методиками приготовления гистологического материала для электронной микроскопии.
Контрольные вопросы:
1. Какие виды гистологических препаратов вы знаете?
2. Каковы основные этапы приготовления гистологических срезов?
3. В чем заключается сущность фиксации тканей и органов? Какие бывают фиксаторы и каков механизм их действия?
4. Для чего используют заливку в твердые среды (парафин и др.) гистологических объектов?
5. С какой целью применяют замораживание кусочков органов?
6. С какой целью применяют окрашивание препаратов? Какие основные группы красителей используют в гистологических исследованиях? Почему структуры называют оксифильными или базофильными?
7. Для чего производят «заключение» препарата, какие среды для этого применяют?
8. Какие методы называют гистохимическими, в чем их сущность?
9. Назовите методы прижизненного исследования клеток и тканей.
10. В чем состоят особенности приготовления препаратов для электронной микроскопии?
Ситуационные задачи:
1. Врач должен срочно получить ответ о состоянии органа. Каким методом можно быстро приготовить гистологический срез?
2. Необходимо выявить наличие жира в клетках. Какой фиксатор вы рекомендуете использовать?
3. Вами получен материал, фиксированный спиртовым фиксатором. Какие этапы обработки можно исключить?
4. При исследовании клеток в люминесцентном микроскопе после окрашивания акридиновым оранжевым вы обнаружили зеленое и красное свечение структур. Каков их химический состав?
Подтема 2
МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Основными методами исследования гистологических объектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в клинической и экспериментальной практике.