Методи роботи з мікроорганізмами

1.1 Порядок проведення посіву та пересіву мікроорганізмів

Для виділення мікроорганізмів з виробничих і природних субстратів, підтримки в активному стані чистих культур, приготування культур з метою передачі у виробництво і т.п. у лабораторній практиці користуються методами посіву та пересіву. Посівом, або інокуляцією, називається внесення мікробного матеріалу в стерильне поживне середовище. Пересів – це перенесення вирощеної на поживному середовищі культури мікроорганізмів на інше стерильне поживне середовище. Під час посіву (пересіву) мікроорганізмів потрібно дотримуватися таких правил (рис 44):

1. Запалити спиртівку або газовий пальник.

2. У ліву руку взяти дві пробірки: одну – зі стерильним середовищем, іншу (ближчу до себе) – з культурою, які тримають у нахиленому положенні. Великим і вказівним пальцями правої руки тримати бактеріологічну петлю, простерилізовану у полум’ї пальника.

3. З обох пробірок вийняти ватні пробки, притиснути їх мізинцем і безіменним пальцем правої руки до долоні та обпалити краї пробірок, стежачи за тим, щоб пробки не торкалися сторонніх предметів.

4. Петлю ввести у пробірку з культурою, яку пересівають. Обережно, не торкаючись стінок, відібрати краплю рідкої культури. У разі проведення пересівання із скошеного шару агару для охолодження петлі спочатку доторкнутися нею до поверхні агару, де немає культури, після чого взяти невелику кількість мікробної біомаси.

5. Не торкаючись стінок пробірки, петлю змікроорганізмами ввести у пробірку й сполоснути у стерильному рідкому середовищі. У разі внесення клітин,взятих петлею з щільного середовища,матеріал ретельно розтерти по стінці пробіркиі верхньому краю рідкого середовища,весь час змиваючи його середовищем.

Якщо проводять пересівання на щільне поживне середовище (скошений шар агаризованого середовища), петлю з клітинами мікроорганізмів опускають додна пробірки, де скупчується невелика кількість конденсаційної води. Злегка торкаючись петлею поверхні косяка, але не руйнуючи його, проводять зигзагоподібний штрих.

6. Петлю вийняти, обпалити краї пробірок і внутрішні кінці пробок, після чого пробірки закрити.

7. Петлю знову прожарити у полум’їпальника.

8. На пробірці зазначити назву культури і дату посіву (підпис зробити чорнилом або олівцем по склу). Засіяні пробірки вмістити у термостат для вирощування при оптимальній для цього виду культури температурі.

Описані прийоми слід виконувати біля полум’я пальника для запобігання забруднення культур сторонніми мікроорганізмами. Не можна робити різких рухів, ходити тощо біля того, хто працює з чистою культурою, оскільки рух повітря посилює небезпеку випадкового зараження культури та середовища. Пересівати мікроорганізми краще в стерильному боксі.

Рис. 44. Пересів культури мікроорганізму:1 – обжарювання петлі; 2 –обжарювання країв пробірок; 3 – набір культури; 4 – посів культури; 5 – обжарювання країв пробірок; 6 – обжарювання петлі

Посів у рідке середовище можна робити петлею або піпеткою (пастерівською або градуйованою). Обидві пробірки тримають у злегка похиленому положенні, щоб не замочити ватяні пробки. Петлю з мікробним матеріалом опускають безпосередньо в стерильне середовище й обполіскують.

При внесенні клітин, узятих петлею зі щільного середовища, матеріал ретельно розтирають по стінці пробірки у верхнього краю рідкого середовища, увесь час змиваючи його середовищем.

Посів на щільні середовища. Посіви петлею на скошеному агарі виконують зиґзаґоподібним штрихом, вільно ковзаючи петлею по поверхні щільного середовища від одного краю пробірки (чашки Петрі) до іншого; або прямою рискою, для цього петлею проводять пряму лінію знизу догори посередині поверхні поживного середовища або суцільним посівом, розтираючи матеріал обережними круговими рухами по всій поверхні середовища.

Посів у чашки Петрі виконують у такий спосіб: щільне поживне середовище у пробірках або колбах розплавляють на киплячій водяній бані, охолоджують до 48 – 50 °С і, дотримуючись правил стерильності, розливають рівним шаром товщиною 10 – 15 мм у стерильні чашки. Застигле середовище можна злегка підсушити в термостаті. Посів виконують скляним шпателем Дригальского або петлею у вигляді паралельних або зиґзаґоподібних штрихів (метод виснажливого штриха).

У стовпчик агаризованого середовища посів виконують уколом (рис. 45).

Засіяні і підписані пробірки, колби або чашки Петрі ставлять у термостат для вирощування.

Рис. 45. Посів уколом

1.2. Методи одержання накопичувальних культур

Накопичувальними (елективними) називають культури, в яких переважають представники близьких видів або навіть одного виду мікроорганізмів. Для одержання таких культур створюють умови, що забезпечують переважний розвиток виду, який виділяють. Для цього використовують селективні середовища, а також варіюють такими факторами, як рН, температура, окисно-відновний потенціал, вводять певні антибіотики та ін. Так, збільшуючи кислотність середовища, усувають можливість розвитку бактерій і створюють сприятливі умови для розмноження дріжджів і міцеліальних грибів. Одержання накопичувальних культур термофільних організмів здійснюють при температурі 45 – 65 °С, рідше при 70 – 75 °С. Внесення в середовище певних концентрацій пеніциліну сприяє розвиткові грамнегативних бактерій або дріжджів. Неоміцин або пеніцилін спільно зі стрептоміцином придушують бактеріальну мікрофлору і створюють умови для переважного розвитку дріжджів. Ністатин, навпаки, перешкоджає життєдіяльності дріжджів, не впливаючи на бактерії. Для одержання накопичувальних культур аеробних мікроорганізмів поживне середовище наливають тонким шаром (1,5 – 2 см) у колби і культивують на качалках. Для збагачення анааеробними мікроорганізмами середовища розливають доверху у високі пробірки або флакончики з притертими пробками. У результаті повторних пересівів на те саме елективне середовище і створення сприятливих умов для видів культура поступово збагачується мікроорганізмами з бажаними властивостями і збіднюється супутніми формами.

1.3. Методи виділення чистих культур

Вивчати морфологічні, культуральні, фізіологічні особливості мікроорганізмів, застосовувати мікроорганізми на виробництві можна за наявності чистих культур. Чиста культура – це популяція генетично споріднених клітин, одержаних із однієї батьківської клітини.

Найчастіше чисту культуру виділяють з елективних культур.

Після одержання елективної культури розпочинають виділення чистої культури. Існує декілька методів виділення чистих культур. Вони всі ґрунтуються на ізолюванні від мікробної популяції однієї клітини (однієї колонії).

Виділення чистої культури з однієї колонії. Цей метод запровадив у мікробіологічну практику німецький учений Роберт Кох. Для виділення необхідно мати три-чотири стерильні чашки Петрі, пробірки або колбочки з щільними поживними середовищами, петлю або стерильну піпетку, шпатель Дригальського, елективну культуру, пальник. Перед початком роботи стіл протерти ватним тампоном, змоченим у спирті, ретельно вимити і продезінфікувати 70 % розчином спирту руки.

Щільні поживні середовища розплавити у киплячій водяній бані, охолоджують до температури 45 – 50 °С і розлити у чашки Петрі. Для цього колбу або пробірку з середовищем взяти правою рукою, тримаючи в похилому положенні, вийняти ватну пробку. Горловину посудини обпалити у полум’ї пальника і, відкривши великим і вказівним пальцями лівої рукикришку чашки Петрі, швидко вилити розплавлене середовище (15...20 см³) так, щоб дно чашки було повністю ним покрите. Кришку відразу закрити, чашки залишити в горизонтальному положенні на столі до повного застигання середовища.

За поверхневого способу виділення аеробних мікроорганізмів краплю культури або її розбавлення нанести петлею чи піпеткою в центр застиглого середовища, трохи відкриваючи кришку чашки Петрі. Обережно розтерти її стерильним шпателем Дригальського по всій поверхні середовища в чашці, після чого цим самим шпателем із залишками матеріалу протерти поверхню середовища послідовно в другій, третій, рідше – у четвертій чашці Петрі. При цьому кришка кожної чашки має бути відкритою настільки, щоб у щілину міг пройти лише шпатель. Після закінчення роботи скляний шпатель вмістити у дезінфікувальний розчин.

Розсівати елективну культуру на поверхню поживного середовища можна і петлею (рис. 46).

Рис. 46. Розсів культури мікроорганізмів на поверхню поживного середовища: А – шпатель Дригальського; Б – розсів; В – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем; Г – ріст мікрорганізмів після розсіву петлею (в трьох чашках); Д – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею (в одній чашці)

Отже, таким способом можна виділяти чисті культури виробничих дріжджів, бражки, молока, води, пива, вина, квасу, тіста, ґрунту, змивів сировини тощо, заздалегідь підготувавши розбавлення у стерильній воді або у фізіологічному розчині (0,85 %-й розчин натрію хлориду).

Після розсіву чашки Петрі підписати, перевернути догори дном, щоб утворена під кришкою конденсаційна вода не капала вниз і не розмивала ізольовані колонії. Чашки Петрі витримувати 2 – 7 діб у термостаті, оскільки швидкість росту у різних мікроорганізмів неоднакова, і щодня їх переглядати. Кожна клітина залишається на тому самому місці середовища, куди вона потрапила в момент розсіву. Тут клітини матимуть сприятливі умови для свого розвитку, починають розмножуватися й утворюють колонії, тобто виникає дуже велика кількість клітин одного виду. Колонії, що виросли, оглядають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи і під мікроскопом.

При огляді колоній звертати увагуна форми і розміри колоній, їхнє забарвлення і забарвлення субстрату, характер поверхні колоній та їхніх країв, вид колоній та ін. Ізольовану колонію, що відрізняється від інших зовнішніми ознаками та міститься на відстані не менш як 1 см від інших колоній, відсіяти стерильною петлею в окрему пробірку з рідким середовищем або на поверхню скошеного твердого середовища.

Мікроорганізми, які належать до факультативних анаеробів, найчастіше виділяють глибинним посівом. Для цього розплавлені агаризовані поживні середовища слід розливати по 15 – 20 см³ у пробірки і простерилізувати. Безпосередньо перед виділенням чистої культури середовища в пробірках розтопити у водяній бані. Після охолодження до температури 48 – 50 °С стерильною петлею внести краплю елективної культури у першу пробірку, закрити її ватною пробкою, вміст перемішати, після чого дві-три краплі суміші перенести у другу пробірку. Потім п’ять-шість крапель з другої пробірки перенести у третю. Таким чином одержують ряд розбавлень посівного матеріалу,якийпісля переміщування між долонями обох рук стерильно виливають у чашки Петрі. Середовище з мікроорганізмами розподілити рівним шаром по дну кожної чашки і поставити на горизонтальну поверхню для застигання. При цьому працювати з агаризованими середовищами слід швидко, оскільки при температурі 40 °С вони застигають.

Для виділення анаеробних мікроорганізмів за методом Коха необхідно обмежити доступ кисню до культури. З цією метою поверхню глибинного посіву в чашці Петрі заливають стерильною сумішшю парафіну і вазеліну (1:1). Можна використовувати спеціальні стерильні трубки довжиною 20 – 30 см і діаметром 0,4 – 0,7 см, зроблені за типом піпеток Пастера. Після заповнення трубки сумішшю розбавлення накопичувальної культури і розплавленого й охолодженого поживного середовища трубку запаюють із двох сторін (з боку капіляра й у місці перетяжки). Можна залишати посівний матеріал, ретельно перемішаний з агаризованим, добре освітленим поживним середовищем, безпосередньо в звичайній пробірці. Ватяну пробку заміняють гумовою або заливають поверхню агару сумішшю парафіну і вазелінової олії. Щоб дістати вирослі колонії анаеробних мікроорганізмів, пробірки або трубки злегка нагрівають, швидко обертаючи над полум'ям пальника. Агар, що прилягає до стінок, розплавляється, і стовпчик вислизає в підготовлену стерильну чашку Петрі. Стовпчик агару розрізають стерильним ланцетом, колонії витягають стерильною петлею або стерильною капілярною трубкою і переносять у рідке середовище.