Качественная реакция на кетоновые тела

К кетоновым телам относятся ацетон, ацетоуксусная и (3-гидро-ксимасляная кислоты. Содержание в крови; ацетон — 2%, ацетоуксусная кислота — 20% и b- гид роксимасляная кислота — 78%. Кетоновые тела появляются в моче (кетонурия) при увеличении их содержания в крови (кетонемия). В норме с мочой выделяется минимальное количество кетоновых тел (20—50 мг/сут), которое не обнаруживается обыкновенными качественными пробами.

Кетонурия появляется при сахарном диабете, голодании, исключении из пищи углеводов. Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом оранжево-красное окрашивание (проба Люголя). После подкисления концентрированной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.

Реактивы, исследуемый материал:

1) раствор нитропруссида натрия — 100 г/л;

2) концентрированная уксусная кислота;

3) раствор №ОН — 100 г/л;

4) моча.

Ход работы

В пробирку вносят 1 каплю мочи, 1 каплю раствора едкого натра и I каплю свежеприготовленного нитропруссида натрия. Наблюдают появление оранжево-красного окрашивания. Добавляют 3 капли концентрированной уксусной кислоты — появляется вишневое окрашивание.

Результат: ______________________________________________________

_____

Вывод______________________________________________________________

__________

Качественные реакции на желчные кислоты

Присутствие желчных кислот можно обнаружить реакцией Петтенкофера. Желчные кислоты дают пурпурное окрашивание с окси-метилфуролом, образующимся из фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты.

Реактивы:

1) сахароза, 20% раствор;

2) серная кислота, концентрированная;

3) желчь, разведенная водой в 2 раза.

Ход работы

На сухое часовое стекло наносят 1 каплю желчи и 1 каплю раствора сахарозы, хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Рядом наносят 3 капли концентрированной серной кислоты (стекло не сдвигать с места). Через некоторое время на месте слияния капель наблюдают развитие красного окрашивания, переходящего при стоянии в красно-фиолетовое.

Результат: ______________________________________________________

_____

Вывод______________________________________________________________

__________

X.ТЕМА НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Определение мочевой кислоты в моче

Принцип метода Мочевая кислота способна восстанавливать фосфовольфрамовый реактив в фосфовольфрамовую синь, количество которой определяется путем титрования красной кровяной солью. При этом фосфовольфрамовая синь окисляется и синее окрашивание исчезает.

Реактивы:1)фосфовольфрамовый реактив Фолина (100 г вольфрамита натрия, 80 мл 85% фосфорной кислоты заливают 900 мл воды и кипятят 2 ч в колбе с обратным холодильником, после охлаждения объем доводят водой до I л); 2) 20% Na₂С0₃; 3) 0,01 и. раствор красной кровяной соли (феррицианида калия) (к 3,292 г К₃[Fе(СN)₆) добавляют 2 г NaОН и растворяют в 1 л воды); 4) стандартный раствор мочевой кислоты — 0,5 мг/мл (к 0,5 г высушенной в эксикаторе мочевой кислоты прибавляют 0,5 г Li₂СО₃, 25 мл воды и нагревают при 50—60 °С до растворения, после охлаждения объем доводят до 1 л).

Ход работы: к 1,5 мл мочи добавляют 1 мл 20 % раствора карбоната натрия и 1 мл фосфовольфрамового реактива, перемешивают и титруют 0,01 н. раствором К₃[Fe(СN)₆] до исчезновения синего окрашивания.

Расчет: (мочевая кислота, ммоль/сут) = 0,8*А*В*0,0059/1,5

где 0,8 -- миллиграммы мочевой кислоты, соответствующие 1 мл К₃[Fe(СN)₆]; А — количество красной кровяной соли, ушедшей на титрование; В — суточный диурез, мл; 1,5 — количество взятой для анализа мочи, мл; 0,0059 — коэффициент пересчета в единицы системы СИ.

Результат: ___________________________________________________________

_____

Вывод_______________________________________________________________

________________________

Теоретические основы ПЦР

ПЦР применяется для молекулярно-генетического исследования образцов ткани. Метод ПЦР позволяет избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Используются:

1) термофильная ДНК-полимераза (Таg-полимераза);

2) специальный прибор - термальный циклизатор(амплификатор ДНК), позволяющий задавать температурный режим (90 °С, 30—50 °С, 60—-70 °С); временные параметры; количество циклов.

Процесс полностью автоматизирован. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка.

Ход работы.Для подготовки реакционной смеси необходимы:

1) исследуемая ДНК;

2) субстраты: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ;

3) два праймера;

4) термофильная ДНК-полимераза (Та^-полимераза);

5) буфер, содержащий Мg²⁺.

Из исследуемого материала (кровь, моча, гистологические срезы, околоплодные воды и др.) выделяют ДНК.

Искусственно синтезированные праймеры представляют собой олигодезоксирибонуклеотиды (20—30 нуклеотидных остатков). Для синтеза праймеров необходимо знать нуклеотидную последовательность амплифицируемой области ДНК (первичную структуру). Праймеры должны быть комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка.

Расчет: (мочевая кислота, ммоль/сут) = 0,8*А*В*0,0059/1,5

Результат: ___________________________________________________________

_____

Вывод_______________________________________________________________

________________________

Теоретические основы ПЦР

3) термофильная ДНК-полимераза (Таg-полимераза);

4) специальный прибор - термальный циклизатор(амплификатор ДНК), позволяющий задавать температурный режим (90 °С, 30—50 °С, 60—-70 °С); временные параметры; количество циклов.

Ход работы.Для подготовки реакционной смеси необходимы:

6) исследуемая ДНК;

7) субстраты: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ;

8) два праймера;

9) термофильная ДНК-полимераза (Таg-полимераза);

10)буфер, содержащий Мg²⁺.

Из исследуемого материала (кровь, моча, гистологические срезы, околоплодные воды и др.) выделяют ДНК.

Этапы циклизации

I этап — денатурация.Реакционную смесь нагревают до температуры 90 °С в течение нескольких минут. Нагревание приводит к разрыву слабых связей между основаниями молекулы ДНК и образованию из исследуемой двухцепочечной матричной ДНК одноцепочеч-ных молекул.

II этап — гибридизация ДНК с праймерами.Температуру снижают до 30—50 °С. При этой температуре возможна специфическая гибридизация цепей ДНК с праймерами.

III этап - элонгация (полимеризация).Это синтез последовательностей, комплементарных матричной ДНК. При температуре 60—70 °С, оптимальной для работы Таg-полимеразы, начинается полимеразная цепная реакция. Перемещаясь по матрице в направлении 5'-конца, Таg-полимераза удлиняет праймер, присоединяя к нему один за другим нуклеотидные остатки, комплементарные нуклеотидам матрицы.

Дальнейший процесс ПЦР заключается в чередовании циклов. Продолжительность каждого цикла зависит от длины и первичной структуры амплифицируемого участка, но, как правило, не превышает 3—5 мин.

За каждый цикл происходит двукратное увеличение числа синтезированных копий, т. е. содержание продуктов амплификации в реакционной смеси нарастает в геометрической прогрессии.

Этот трехступенчатый цикл может быть повторен многократно, пока не образуется достаточно материала, необходимого для дальнейших исследований.

Полученный материал подвергают фракционированию методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающихся только на один нуклеотид.

По сравнению с традиционными методами диагностики данный метод позволяет проводить быструю, чувствительную и специфическую идентификацию генетического материала.

В медицинской диагностикепри помощи этого метода можно решать многие вопросы:

* Идентифицировать вирусную и бактериальную ДНК в составе ДНК человека.

* Проводить пренатальную диагностику наследственных болезней.

* Выявлять гетерозиготных носителей дефектных генов.

* Определять точную локализацию генов в ДНКчеловека.

* Идентифицировать дефектные гены, нарушающие регутяцию пролиферации клеток и вызывающие развитие опухолевых заболеваний.

*Проводить анализ и идентифицировать препараты, содержащие сильно деградированную ДНК.

XI.ТЕМА СИНТЕЗ БЕЛКА