Количественного исследования микроструктур

В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ

(ОБЪЕКТАХ)

Количественная оценка микроструктур является необходимым условием получения объективных данных об их состоянии в норме, при экспериментальных воздействиях и в патологии. Основными количественными показателями микроструктур являются морфо метрические (число структур и их геометрические параметры) и денситометрические, отражающие концентрацию (оптическую плотность) химических веществ в микроструктуpax. Для выявления этих параметров применяют морфометрические и спектрофотометрические методы, а также автоматизированные системы обработки изображений.

Морфометрия

Морфометрия включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. В качестве объектов могут быть использованы изображения гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков и др.), а также микрофотографии. Измерение числа структур, их площадей, диаметров, периметров и других показателей производится с помощью специальных сеток (Е. Р. Вейбеля, А. А. Глаголе­ва, С. Б. Стефанова), курвиметра, метода вычисления весовых соотношений путем взвешивания. Измерения микроструктур в световых микроскопах про­изводят с помощью окуляр-микрометра или вышеуказанных сеток, вставляе­мых в окуляр микроскопа. Морфометрия электронно-микроскопических изо­бражений является разновидностью морфометрии, где измерение геометрических характеристик производят также с помощью сеток непосредственно на экране электронного микроскопа либо на электронных микрофотографиях. Рассмотрим некоторые примеры морфометрических исследований гисто­логических структур.

1. Измерение микроструктур с помощью окуляр-микрометра. На пред­метный столик микроскопа устанавливают объект-микрометр. Под микро­скопом определяют число делений объект-микрометра, соответствую­щих числу делений окулярной измерительной линейки (окуляр-микрометра). После чего, пользуясь шкалой окуляр-микрометра, производят измерение объектов.

2. Измерение микроструктур с помощью морфометрических сеток. Мор­фометрические сетки используются для планиметрических (измерение пло­щадей структур) и стереометрических (определение доли объемов компонен­тов структур от общего объема) исследований. Например, можно использо­вать сетку, состоящую из линий постоянной длины, расположенных на равном расстоянии друг от друга таким образом, что получается сетка из рав­носторонних треугольников. При таком расположении отрезков каждая кон­цевая тестовая точка равнозначна абсолютной величине площади (а)

где Z — длина тестовой линии. Стереометрические исследова­ния можно производить с помощью любой сетки, в которой тестовые точки лежат на равном расстоянии друг от друга, по формуле

где —доля объема, который занимает изучаемый компонент структуры от общего объема; Pi — число тестовых точек, приходящихся на данный ком­понент; P_t — общее число тестовых точек, приходящихся на всю структуру. При таком исследовании стереометрические данные получаются в относи­тельных цифрах — долях объема в процентах от общего объема.

Микроспектрофотометрия

С помощью этого метода моно определить химический состав, концентрацию и количество различных веществ, содержащихся в конкретных структурах клеток и тканей. При микроспектрофотометрии измеряется коли­чество лучистой энергии, прошедшей через определенный элемент структуры препарата, зависящее от содержания вещества (и его химического состава) в этом элементе. Спектрофотометрирование микрообъектов проводят на при­борах — микроспектрофотометрах, представляющих собой комбинацию мик­роскопа со спектрофотометром, снабженных фотоэлектрическим приемником света. Основными узлами установок для микроспектрофотометрирования яв­ляются: 1) источник излучения, 2) монохроматор (обеспечивает получение света необходимой длины волны), 3) микроскоп и приемник лучистой энер­гии (фотоэлектронный умножитель). Свет от источника (ксеноновая или ртутная лампа высокого давления) направляется через монохроматор, кото­рый выделяет излучение нужной длины волны для освещения препарата. Интенсивность излучения в заданной точке препарата регистрируется с по­мощью фотоэлектронного умножителя. Далее сигнал поступает в автомати­ческий графопостроитель. Для исключения ошибок в измерении необходимо соблюдать стандартность условий: использовать стекла и препараты одина­ковой толщины, одинаковую величину регистрирующего зонда и др.

В качестве примера рассмотрим определение содержания ДНКв лим­фоцитах крови.

Лимфоциты в мазках крови, окрашенных по Фельгену, микроспектрофотометрируются с использованием излучения с длиной световой волны 570нм. В результате измеряется содержание ДНК в участке ядра лимфоцита, рав­ном по площади размеру регистрирующего зонда. Содержание (m) ДНК во всем ядре лимфоцита определяют по формуле

где с — содержание ДНК в участке, равном по площади размеру зонда; а— площадь зонда; s — площадь ядра лимфоцита.

Размер зонда выбирается, исходя из задачи исследователя и увеличе­ния объектива микроскопа, площадь ядра клетки определяется при помощи окуляр-микрометра.

Автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз)

Автоматизация определения количественных параметров (морфометриче­ских и денситометрических) изображений структур, получаемых в световых и электронных микроскопах, позволяет объективизировать их оценку, значи­тельно снизить трудоемкость операций и повысить эффективность иссле­дований.

В состав автоматизированных систем обработки изображений входят специальные сканирующие микроскопы, оснащенные фотометрическим или телевизионным приемником изображения. Видеосигнал, несущий информа­цию об анализируемом изображении, подается со сканирующего микроскопа в электронную вычислительную машину (ЭВМ).ЭВМ производит матема­тическую обработку изображения и выдает информацию о геометрических, фотометрических, текстурных характеристиках исследуемых объектов. При использовании достаточно мощных ЭВМ и специальных программ с по­мощью АСОИз можно автоматически распознавать и классифицировать ис­следуемые объекты и структуры, осуществлять их трехмерную реконструк­цию, а при необходимости математически моделировать изображения структур при различных воздействиях или патологии.

Рассмотрим схему автоматизированного анализа изображений клетки крови. Он состоит из следующих этапов: 1) сканирование клетки для получения цифровой матрицы ее изображения, 2) ввод цифрового изображения в ЭВМ, 3) обработка на ЭВМ цифрового изображения с целью нахождения количественных характеристик объекта, 4) выдача результатов на печать или дисплей.

Цель занятия — изучение принципов получения количествен­ных характеристик микроструктур с помощью морфометрических и спектрофотометрических методов.

Задачи:

1. Овладение морфометрическими методами изучения структур гистологических препаратов.

2. Овладение морфометрическими методами изучения уль­траструктур на электронных микрофотографиях.

3. Ознакомление с методами микроспектрофометрии и получения денситометрических характеристик — концентрации и содержания веществ в клетках.

4. Ознакомление с автоматизированными системами обработки изображений клеток и тканей.

Задания:

1. С помощью окулярной сетки (или окуляр-микрометра) произвести измерение диаметра и площади клетки, ее ядра и вычислить ядерно-плазматическое отношение.

2. На электронной микрофотографии с помощью сетки определить количество и основные морфометрические параметры митохондрий, гетеро- и эухроматина.

3. На основании показателей микроспектрофотометра и морфометрических параметров определить содержание ДНК или РНК в клетке.

4. Определить гистохимический показатель активности ферментов в лейкоцитах крови (по Астальди и Верга).

5. Ознакомиться с устройством и работой автоматизированной системы обработки изображений «Протва-М 11» и др.

Контрольные вопросы:

1. Какие параметры клеток можно определять с помощью метода морфометрии?

2. Каков принцип работы с морфометрической сеткой?

3. В чем состоит принцип микроспектрофотометрии и какие характеристики клеток можно изучать на микроспектрофотометре?

4. Из каких основных частей состоят автоматизированные системы обработки изображений и какие параметры клеток на них можно исследовать?

Л ИТЕРАТУРА

Основная

Гистология / Под ред. Афанасьева Ю. И., Юриной Н. А. М.: Медицина, 1989, с. 15-21.

Дополнительная

Агроскин Л. С, Папаян Г. В. Цитофотометрия. — Л.: Наука, 1977.

Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологи­ческой техникой.— М.: Медицина, 1982.

Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. Будапешт, 1962, с. 17-147.

Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. Л.: Медицина, 1969, с. 7-113.

Оптико-структурный машинный анализ в биологии и медицине. — М.: изд. УДН, 1984.

Основы общей гистологии и гистологическая техника / Под ред. проф. В. Г. Елисеева. — М.: Медицина, 1967.

Пирс Э. Гистохимия.— Пер. с англ.—М.: Изд-во иностр. лит., 1962.

Ромейс Б. Микроскопическая техника.— Пер. с нем. — М.: Изд-во иностр. лит., 1954.

Ташкэ К. Введение в количественную цитогистологическую морфометрию.— Бухарест: Изд-во АН СРР, 1980.

Тема

ЦИТОЛОГИЯ

Цитология — наука о клетке, об общих закономерностях, присущих кле­точному уровню организации живой материи. Клетка (cellula) — наименьшая структурная единица живого, она является основой развития, строения и жизнедеятельности всех животных и растительных организмов.

Несмотря на большое многообразие, все клетки имеют ряд общих струк­турных признаков. Клеточная теория формулирует это положение как гомологичность, т. е. принципиальное сходство строения клеток всех животных и растительных организмов. Так, для клеток характерно наличие цитоплазмы (cytoplasma) и ядра (nucleus). Цитоплазма включает в себя гиалоплазму (hyaline — прозрачный), или матрикс цитоплазмы; органеллы (organellae cytoplasmicae), представляющие собой постоянные образования, имеющие характерную структуру и специфическую функцию в клетке, и включения (inclusiones) — временные образования, являющиеся продуктом деятельности клетки. Цитоплазма отделена от окружающей клетку среды и от соседних клеток плазмолеммой — внешней клеточной мембраной (plasmolemma). Ядро имеет ядерную оболочку, хроматин, ядрышко и нуклеоплазму (рис. 1).

Рис. 1. Схема ультрамикроскопического строения клетки

животных организмов:

1 — ядро клетки; 2 — плазмолемма; 3 — микроворсинки; 4 — аграну-лярная эндоплазматическая сеть; 5 —гранулярная эндоплазматическая сеть; 6 — комплекс Гольджи; 7 — центриоль и микротрубочки центросферы; 8 — митохондрии; 9 — эндоцитозные вакуоли; 10— лизосомы; 11 — микрофиламенты; 12 — рибосомы; 13 — выделение гранул секрета (Гистология / Под ред. В. Г. Елисеева, Ю. И. Афанасьева, Н. А. Юриной, 1983).

Кроме клеток в организме встречаются неклеточные структуры: симпласты, синцитии и межклеточное вещество, которые являются производны­ми клеток и также изучаются в курсе цитологии.

Подтема 1

ОБЩАЯ МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК

И НЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР.