Пути передачи сигналов, запускаемых факторами стресса, с помощью активируемых митогеном протеинкиназ (амп-киназ)
Для S. cerevisiae oбнаружено, что увеличение наружного осмотического давления запускает путь передачи сигналов, состоящий из каскада гомологов митоген-активируемых протеинкиназ [5]. Дальнейшие исследования показали, что подобная молекулярная стратегия характерна и для других видов дрожжей, а так же для млекопитающих [2].
1. Осмосенсоры. Многоступенчатое фосфорилирование является универсальным механизмом передачи сигналов как у прокариот, так и у эукариот [6].
Каскадный путь передачи сигналов (АМП-киназный каскад), функционирующий во многих путях передачи сигналов у эукариот состоит из АМП-киназы - (АМПК), АМП-киназы киназы (АМПКК) и АМП-киназы киназы киназы (АМПККК). Такие каскады из трех киназ служат связующим звеном между рецепторами клеточной поверхности и эффекторами цитоплазмы и ядра. Однако, функциональное значение наличия именно трех киназ в каскаде до конца не выясненно. Не исключено, что серия киназ обеспечивает получение сигналов от различных рецепторов [7].
У дрожжей S. cerevisiae при повышении осмотического давления начинает функционировать АМП-киназный каскад, включающий АМП-киназу, кодируемую геном HOG1 и АМП-киназу киназы, кодируемую геном PBS2. Белок, кодируемый геном PBS2 активируется двумя независимыми сигналами, получаемыми от двух различных осмосенсоров клеточной поверхности:
1) Продукт гена PBS2 активируется двумя АМП-киназы киназы киназами, кодруемыми генами SSK2 и SSK22, соответственно, которые находятся под контролем двухкомпонентного осмосенсора SLN1-SSK1 [7]. Интересен тот факт, что разрушение генов HOG1 или PBS2 ведет к уменьшению осморезистентности, а разрушение SSK1 не ведет. Это позволяет предположить наличие комплексного механизма активации этого АМП-киназного каскада [5]. Следует также заметить, что роль SLN1 не ограничивается осморегуляцией [8].
По-видимому, осмосенсором, регулирующим PBS2-HOG1 АМП-киназный каскад является двукомпонентная система, состоящая из трансмембранного сенсора - гистидин-киназы, кодируемой геном SLN1, и цитоплазматического регулятора ответа, кодируемого SSK1.
Продукт гена SLN1 относится к подтипу сенсоров, которые содержат как гистидинкиназный домен, так и рецепторный домен в одной и той же молекуле белка [7]. Вероятно, Sln1p является сенсором наружного осмотического давления, и негативно регулирует PBS2-HOG1 путь. Разрушение SLN1 является летальным из-за сверхактивации PBS2-HOG1 пути [5].
Ген SSK1 кодирует белок, до натоящего времени невыделенный. Аминокислотная последовательность этого белка должна содержать рецепторный домен, гомологичный бактериальному [7].
Возможный механизм работы SLN1-SSK1 “двухкомпонентной” системы передачи сигнала представлен ниже. При активации сигналом, поступающим из внешней среды, его гистидинкиназа фосфорилирует (или гомо- трансфосфорилирует) остаток Гис 576. Фосфатная группа затем переносится на остатки аспартата рецепторноых доменов продуктов генов SLN1 (Асп 1.144) и SSK1 (Асп 554). Дефосфорилирование SSK1 белка передает сигнал, который стимулирует PBS2-HOG1 АМП-киназный каскад. Таким образом, разрушение гена SLN1 ведет к постоянной активации АМП-киназного каскада, что, в свою очередь, вызывает гипертрофированный осморегуляторный ответ, например чрезмерное накопление глицерина [5]. Кроме того, уменьшение синтеза глицерина при мутации hog1 восстанавливается мутацией sho1 путем индукции синтеза глицерофосфат дегидрогеназы [9].
Хотя роль Sln1p-Ssk1p как активатора пути передачи осмосигналов ясна, мутанты с разрушенным SSK1 геном не обладают абсолютной осмочувствительностью. Что делает вероятным существование альтернативного осмосенсора [5].
2) Недавно были получены доказательства, что Pbs2p-киназа альтернативно активируется механизмом, который включает в себя связывание ее NH2-терминальной, обогащенной пролином последовательности с SH3-доменом предполагаемого трансмембранного осмосенсора Sho1p [7].
Ген SHO1 кодирует белок, состоящий из 367 аминокислотных остатков. NH2-терминальный участок аминокислотной последовательности Sho1p содержит четыре плотно упакованных гидрофобных трансмембранных белковых участка. Так как сигнальная последовательность отсутствует на NH2-терминальном участке, можно предположить цитоплазматическую локализацию как NH2-, так и COOH-терминальных участков Sho1p. Более того, COOH-терминальный участок Sho1p содержит SH3-домен, который связывает богатые пролином участки. Он характерен для большого числа белков, участвующих в передаче сигналов.
Эти структурные особенности позволяют предположить, что Sho1p является компонентом альтернативного пути активации Pbs2p в ответ на повышение внешнего осмотического давления. Наличие SH3-домена в аминокислотной последовательности Sho1p позволяет предположить, что он связывается с белком-мишенью, содержащим богатый пролином участок. Связывание со Sho1p может вызывать автофосфорилирование сайта активационного фосфорилирования Pbs2p, дополняя работу неидентифицированной АМП-киназы киназы киназы (АМПККК), которая активирует Pbs2p.
Как Sln1p, так и Sho1p являются трансмембранными осмосенсорами, которые регулируют активность PBS2-HOG1 пути. Эти два осмосенсора имеют различную зависимость от концентрации и разное время действия:
1) Для мутантов, у которых работает только Sho1p-зависимый путь, фосфорилирование тирозина Hog1p практически не наблюдается при концентрации NaCl ниже 0,2 М, а при концентрации около 0,3 М достигается максимальный ответ; при 0,3 NaCl максимальный ответ продолжается от 3 до 5 мин [6].
2) Для мутантов, у которых активен только Sln1p-зависимый путь, напротив, интенсивность фосфорилирования тирозина Hog1p постепенно возрастает от 0,1 до 0,6 М NaCl; при 0,3 М NaCl максимальный ответ достигается в течение 1 мин [6].
Такие различия, возможно, необходимы для наиболее оптимальной адаптации к быстрым изменениям осмотического давления внешней среды.
2. амПK и АМПKK (HOG1 и PBS2). Увеличение наружного осмотического давления активирует АМП-каскад, ответственный за увеличение экспрессии белков, необходимых для осморегуляции и солеустойчивости, а так же а так же за коррекцию темпов роста и деления клеток в условиях повышения осмотического давления [10]. Для S. cerevisiae были выделены два гена, HOG1 и PBS2, кодирующие компоненты пути передачи осмосигналов. При осмострессе Pbs2p фосфорилирует остаток тирозина в Hog1p, осуществляя, таким образом, передачу сигнала [11].
Одновременно с этим, происходит накопление глицерина, приводящее к повышению внутриклеточного осмотического давления, необходимого для предотвращения потери тургора клетки. Мутанты по генам hog1 и pbs2 обладают осмочувствительным фенотипом, накапливают мало глицерина, и плохо растут на средах с высоким осмотическим давлением [11].
Дрожжевой ген PBS2 отвечает за устойчивость клетка к антибиотику полимиксину В. Кроме того, разрушение PBS2 делает клетку чувствительной к повышению осмотического давления среды: присутствие в среде культивирования таких мутантов 0,99 М NaCl ведет к полной остановке роста, появлению аномальных морфологических форм и, в конечном итоге, к полной гибели культуры.
Транскрипция ряда генов стрессовых белков S. cerevisiae не только осмотическим стрессом, он и недостатком питательных веществ, тепловым стрессом, присутствием в среде Н2О2, большого количества этанола, низким значением рН и некоторыми другими стрессовыми факторами [12]. Такая комплексная модель экспресии облегчает задачу картирования регуляторных цис-элементов, и позволяет определить роль различных путей передачи стрессовых сигналов в клетке.
ЭЛЕМЕНТЫ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА
У дрожжей S. cerevisiae факторы стресса активируют несколько систем контроля транскрипции: элементы стрессового ответа на тепловой шок, связывающие фактор транскрипции теплового шока, элементы общего ответа на стресс, в основном взаимодействующие с фактором ответа на общий стресс, который до сих пор остается гипотетическим, и другие. Потенциал выживания дрожжей в условиях стресса может быть увеличен посредством преадаптации клеток. Процесс подобной преадаптации не требует участия факторов транскрипции теплового шока. Тот факт, что некоторые факторы стресса (например, тепловой шок) может повышать устойчивость к другим стрессовым факторам (таким как повышение осмотического давления среды), позволяет предположить, что эти факторы стресса активируют систему генерального ответа клетки на стресс [12].
Участок ДНК, ответственный за “генеральный” ответ клетки на стресс, был обнаружен в промоторной части ряда дрожжевых генов. Этот элемент соответствует нуклеотидной последовательности ЦЦЦЦT (цитозин-цитозин-цитозин-цитозин-тимин) или AГГГГ (аденин-гуанин-гуанин-гуанин-гуанин), и определяет индуцированнную стрессом транскрипцию генов GPD1, CTT1, HAL1, ENA1, DDR2, HSP12. Помимо этого, вышеназванная ДНК-последовательность обнаружена в промоторах ряда других генов. Она индуцируется различными факторами стресса, например, тепловым шоком, низким значением рН, высоким осмотическим давлением и т.д.
Недавно было показано, что быстрая передача сигнала о повышении осмотического давления среды к ЦЦЦЦТ-элементу промотора гена осуществляется через АМП-киназный путь передачи сигналов [10], по механизму, не требующему синтеза новых белков [13].