Адаптация дрожжей к солевому стрессу

АДАПТАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ К СОЛЕВОМУ СТРЕССУ

УДК 581.1

(Обзор)

Е.Н. Андреищева, Р.А. Звягильская

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, 117071

Обобщены результаты исследований механизмов адаптации различных видов дрожжей к влиянию солевого стресса. Показано, что стрессовый ответ включает в себя как изменение активности различных ферментов, так и индукцию экспрессии ряда генов. Повышение засоления среды можно рассматривать как двухфакторный стресс, имеющий осмотическую составляющую, которая ведет к потере клеткой тургорного давления, и токсическую составляющую, т.к. повышение внутриклеточной концентрации ионов Na⁺ ведет к ингибированию ряда процессов клеточного метаболизма. Адаптация дрожжей к таким условиям требует внутриклеточного накопления осмотически активных веществ (в основном, глицерина) для компенсации внешнего давления, и изменения транспортных систем плазматической мембраны для выброса из клетки ионов Na⁺.

Для природных экосистем с экстремальными, по человеческим меркам, условиями обитания (слишком жарких, закисленных, щелочных, засоленных) характерно отсутствие высших форм жизни, но они широко заселены микробными сообществами, адаптированными к этим условиям. В природе концентрированные солевые растворы встречаются в таких экосистемах, как морские лиманы, соленые болота и озера, либо в антропогенных объектах, подобных карьерам солеразработок. Помимо этих макросистем, огромное множество более мелких экосистем с повышенным засолением (таких, как некоторые продукты питания, кожа человека и животных, поверхность листьев экскретирующих соль пустынных растений) дают богатую почву для развития галофилных и/или солетолерантных микроорганизмов. Засоление, как один из наиболее важных параметров окружающей среды, в настоящее время привлекает пристальное внимание экологов, физиологов микроорганизмов и даже биотехнологов, т.к. механизмы солетолерантности могут иметь большое коммерческое значение [1].

При попадании в неблагоприятную среду, живые клетки демонстрируют быстрый молекулярный ответ на изменение жизненных условий [2], модифицируя свой метаболизм таким образом, чтобы уравновесить вредное воздействие внешних факторов. Такая модификация включает в себя как изменение активности различных ферментов, так и индукцию экспрессии ряда генов. В условиях солевого стресса клетки Zygosacchaomyces rouxii уменьшали свой объем (при 2М NaCl) на 50% в течение первых 30 мин. Это позволяет клетке быстро увеличить концентрацию внутриклеточного раствора, которая у солетолерантных штаммов уравновешивается с внешней средой в течение 2 часов после начала солевого стресса. Солетолерантные мутанты Saccharomyces cerevisiae, способные расти на средах, содержащих до 3 M NaCl, имеют размеры, соизмеримые с размерами бактерий [3]. Солечувствительные штаммы не обладают способностью сокращать свой обьем, а так же неспособны синтезировать и накопливать глицерин [4].

Ниже будут более подробно рассмотрены основные механизмы адаптации дрожжевых клеток к солевому стрессу.

ЭЛЕМЕНТЫ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА

У дрожжей S. cerevisiae факторы стресса активируют несколько систем контроля транскрипции: элементы стрессового ответа на тепловой шок, связывающие фактор транскрипции теплового шока, элементы общего ответа на стресс, в основном взаимодействующие с фактором ответа на общий стресс, который до сих пор остается гипотетическим, и другие. Потенциал выживания дрожжей в условиях стресса может быть увеличен посредством преадаптации клеток. Процесс подобной преадаптации не требует участия факторов транскрипции теплового шока. Тот факт, что некоторые факторы стресса (например, тепловой шок) может повышать устойчивость к другим стрессовым факторам (таким как повышение осмотического давления среды), позволяет предположить, что эти факторы стресса активируют систему генерального ответа клетки на стресс [12].

Участок ДНК, ответственный за “генеральный” ответ клетки на стресс, был обнаружен в промоторной части ряда дрожжевых генов. Этот элемент соответствует нуклеотидной последовательности ЦЦЦЦT (цитозин-цитозин-цитозин-цитозин-тимин) или AГГГГ (аденин-гуанин-гуанин-гуанин-гуанин), и определяет индуцированнную стрессом транскрипцию генов GPD1, CTT1, HAL1, ENA1, DDR2, HSP12. Помимо этого, вышеназванная ДНК-последовательность обнаружена в промоторах ряда других генов. Она индуцируется различными факторами стресса, например, тепловым шоком, низким значением рН, высоким осмотическим давлением и т.д.

Недавно было показано, что быстрая передача сигнала о повышении осмотического давления среды к ЦЦЦЦТ-элементу промотора гена осуществляется через АМП-киназный путь передачи сигналов [10], по механизму, не требующему синтеза новых белков [13].

ТОКСИЧНОСТЬ МЕТАЛЛОВ

1. Ионный гомеостаз клетки. Ионный гомеостаз является одним из фундаментальных свойств живой клетки. Многие важнейшие физиологические параметры, такие как клеточный объем, тургор, внутриклеточное значение рН, ионная сила, концентрации катионов напрямую зависят от регуляции системы входа/выхода основных моновалентных катионов натрия и калия [52]. У эукариот поддержание в клетке высокой концентрации K⁺ и низкой концентрации Na⁺ осуществляется как при помощи первичного активного транспорта, определяемого АТФазами Р-типа, так и вторичного транспорта, представленного каналами и котранспортерами. Энергия АТФ, затраченная на работу ионных помп, может быть вторично использована в виде ионных трансмембранных градиентов для транспорта многих веществ, поддержания возбудимости мембраны и ее целостности [53].

Большинство животных клеток погружено в межклеточное вещество, которое благодаря регуляции на уровне целого организма имеет практически неизменные характеристики осмотического давления, рН, ионных концентраций. В этих клетках (Na⁺,K⁺)-ATФаза в качестве первичной помпы, наряду с Na⁺ и K⁺ каналами, а так же Na⁺/H⁺-антипортерами и (Na⁺,K⁺,Cl^-) симпортерами определяют клеточный объем и ионные концентрации. Поглощение клеткой сахаров и аминокслот осуществляется в котранспорте с Na⁺. Даже незначительные изменения в составе межклеточного вещества передаются через регуляторные протеин- киназы и фосфатазы различным переносчикам [53].

В отличие от животных клеток, клетки растений, водорослей и грибов должны облазать способностью произрастать при достаточно широком спектре значений рН, осмотического давления, ионных концентраций. Достаточно плотные клеточные стенки этих организмов помогают им выдерживать колебания осмотического давления [54].

Однако, физиологические исследования одноклеточных грибов показали, что их способность существовать в условиях изменения ионных концентраций объясняется иной, нежели у животных, стратегией транспорта через клеточную мембрану. Плазматическая мембрана грибов и растений содержит протонную АТФазу [54, 55], за счет работы которой образуется протонный градиент, позволяющий клетке осуществлять сопряженный вторичный транспорт веществ и ионов. Внутриклеточные концентрации Na⁺ и K⁺ могут независимо регулироваться за счет протоннго градиента. У дрожжей S. cerevisiae ген РМА1, кодирует основную АТФазу плазматической мембраны. АТФаза, кодируемая РМА1, составляет более 50% белка плазматической мембраны, и ее активность регулируется значением рН и наличием источника углерода в среде [55]. За последнее время были охарактеризованы гены, определяющие транспорт Na⁺ и K⁺ в неживотных клетках.

Все живые клетки выбрасывают Na⁺, создавая тем самым концентрационный трансмембранный градиент. Для клеток животных, не обладающих клеточной стенкой, такой градиент генерируется натриевой помпой, (Na⁺,K⁺)-АТФaзе, и играет центральную роль в их физиологии, так как большинство транспортов сопряжено именно с ним, в том числе выброс протона (через Na⁺/H⁺-антипортер). Напротив, у клеток эукариот, окруженных стенкой, мембранный потенциал генерируется протонной помпой [56], вторичные транспорты сопряжены с H⁺ [57], и выброс Na⁺, как правило, не является первичным процессом. Однако, получены доказательства функционирования АТФазы Р-типа, работающей на выброс из клетки Na⁺, Li⁺, и вероятно K⁺ у дрожжей S. cerevisiae [58].

2. Потребность в калии и транспорт калия. Все живые клетки используют K⁺ для нейтрализации отрицательного заряда клеточных анионов, поэтому концентрация K⁺ внутри клетки всегда выше, чем в наружной среде. В связи с исключительной важностью для жизнедеятельности, K⁺ является наиболее часто встречающимся в живых клетках катионом. Его концентрация колеблется в пределах 100-500 мМ (исключая некоторые галофильные организмы, для которых характерны гораздо более высокие концентрации K⁺). Следует добавить, что ионы K⁺ необходимы для роста как S. cerevisiae, так и C. utilis [59, 60] на средах, содержащих Na⁺. Организмы, обитающие в условия дефицита K⁺ (почвы, пресная вода), могут поглощать K⁺, преодолевая очень высокий концентрационный градиент. S. cerevisiae обладают способностью в условиях калиевого голодания накапливать в клетке концентрацию K⁺, в 100.000 раз превосходящую наружную, при этом переносчик обладает К_м потребления K⁺ 10-20 мкM [62].

Исключая клетки, нагруженные Na⁺, грибы поглощают K⁺ в обмен на H⁺. Этот обмен позволяет сбалансировать процессы подкисления цитоплазмы, контролировать клеточный рН, и, как следствие, анионы, поступившие в клетку в результате симпорта с протоном, и органические кислоты, синтезированные в самой клетке, переводятся в калиевые соли. Можно предположить, что слишком быстрый или недостаточный обмен приведет к ненормальному повышению или понижению рН цитоплазмы, однако кинетические показатели H⁺ помпы и H⁺/K⁺-обмена противостоят этим отклонениям. Хорошо известно, что любое уменьшение концентрации K⁺ в клетке S. cerevisiae активизирует его поглощение. Внутриклеточное содержание K⁺ у S. cerevisiae так же регулирует и его выброс через специальные каналы-разобщители, работа которых ингибируется снижением концентрации K⁺ в клетке [62].

Интересно, что добавление небольшой концентрации Na⁺ к суспензии клеток, растущих на среде бедной K⁺, вело к увеличению роста культуры; кроме того, снижается потребность клеток в K⁺. Скорость роста S. cerevisiae зависит от содержания K⁺ в среде: ниже определенной концентрации культура гибнет, существует также концентрация насыщения. Rb⁺ и Na⁺ в небольших количествах увеличивают скорость роста культуры и уменьшают концентрацию K⁺, ниже которой культура гибнет, но превышение определенного соотношения Rb⁺/K⁺ и Na⁺/K⁺ ведет к гибели клеток. Таким образом, Na⁺ может как стимулировать, так и ингибировать рост S. cerevisiae. Это говорит о том, что потребности клеток в K⁺ и в сумме K⁺ + Na⁺ различны, происходит наложение потребностей. Но эффект стимуляции роста культуры Na⁺ можно обнаружить только при условии недостатка K⁺ в среде [63].

Первичным источником энергии для большинства транспортов у грибов и растений является протонный градиент, создаваемый протонной АТФазой [64]. Используя мембранный потенциал, созданный H⁺-помпой, клетка может потреблять K⁺ через калиевые каналы. Но подобный механизм не может объяснить потребления клеткой и накопления значительных количеств K⁺, в условиях калиевого голодания [65]. В этом случае, транспорт K⁺ должен быть сопряжен с транспортом других ионов, что значительно увеличивает движущую силу мембранного потенциала.

Для S. cerevisiae клонированы два гена, продукты которых ответственны за потребление K⁺. Это TRK1 [66] и TRK2 [67] гены, причем TRK2 появился, вероятно, в результате генной дупликации. Продукты этих генов являются мембранными белками с высокой степенью гомологии аминокислотной последовательности, которые сильно отличаются от других классов транспортных белков, таких как АТФазы АВС- или Р-типа. Потребление K⁺ посредством этих транспортеров может быть сопряжено с выбросом протона. Белки Trk1p и Trk2p - это близкие по структуре и свойствам, имеющие высокое сродство к K⁺ и Rb (К_м 0,3 мM Rb⁺) переносчики K⁺. Клетки, утратившие TRK1, могут расти на нормальной среде, но абсолютно не способны концентрировать K⁺ из среды с низким его содержанием [68].

У дрожжей-аскомицетов Schwanniomyces occidentalis, выделенных из почвы, был изолирован ген HAK1, кодирующий высокосродственный переносчик K⁺, который способен потреблять K⁺ из среды с содержанием K⁺ менее 0,03 мкМ, К_м для Rb⁺ 1 мкM при росте на бедной K⁺ среде. Причем, величина К_м может изменяться в соответствии с изменением содержания K⁺ в среде [69]. Так, величина К_м для K⁺ высокосродственных переносчиков S. cerevisiae [61] и Sch. occidientalis [69] может уменьшаться в условиях калиевого голодания примерно в 1000 раз. При этом величина К_м для более легкого иона Li⁺ не менялась. Такое явление имеет физиологическую значимость для Na⁺ и Li⁺ устойчивости [70].

3. АТФаза, осуществляющая выброс натрия. Солеустойчивость S. cerevisiae зависит от способности клетки выбрасывать Na⁺ или Li⁺. Гены, определяющие этот выброс, представлены тандемом из четырех генов [71], где ENA1/PMR2 определяет быстрый выход из клетки Na⁺ и Li⁺, тогда как функции генов ENA2, ENA3 и ENA4 изучены пока не полностью, но известно, что их регуляторные и промоторные участки отличаются от таковых участков гена ENA1 [72].

Дрожжевой ген ENA1/PMR2 кодирует АТФазу, вовлеченную в выброс из клетки натрия [73], хотя при кислых значениях рН Na⁺ может выводиться с помощью других систем, например, Н⁺/катион антипортеров [74]. Индукция ENA1 при солевом стрессе осуществляется с помощью двух различных путей передачи сигналов: пути через белок Hog1p, котрый контролирует экспрессию при низких концентрациях NaCl, и пути через кальцинеурин, отвечающего за индкцию при высоких концентрациях NaCl. Эта двойная регуляция может легко объяснить тот факт, что мутанты, утратившие кальцинеурин, остаются способными несколько изменять индукцию ENA1/PMR2 в ответ на колебания концентрации NaCl в среде [52]. Эти два пути отвечают на различные сигналы, связанные с солевым стрессом. Тогда как путь через белок Hog1p реагирует на неспецифический осмотический шок [11], кальцинеурин-зависимая индукция может вызывается только NaCl, но не KCl или сорбитом [73]. Последнее предполагает, что путь через кальцинеурин активируется специфически с помощью ионов Na⁺. Это первое известное упоминание о пути передачи сигналов, активируемом натрием, и природа натриевого сенсора, определяющего активацию кальцинеурина требует дальнейшего изучения [73].

Как уже упоминалось выше, гены, экспрессия которых регулируется с помощью пути через HOG-белок, содержат в своем промоторе ЦЦЦЦТ-элемент. Одиночная, ЦЦЦЦТ-последовательность обнаружена в промоторе ENA1, и это может объяснять осмотическую регуляцию экспрессии этого гена. Однако гены, содержащие функциональный элемент стрессового ответа, имеют, как правило, несколько копий этой последовательности. Кроме того, описан ген, утративший элемент стрессового ответа, но сохранивший возможность регуляции через белок Hog1p. Видимо, дальнейшие исследования помогут выявить в промоторе ENA1 цис-активирующий элемент, отвечающий на сигналы нескольких путей [73].

Как и для других генов, экспрессия которых находится под контролем HOG, РКА является негативным регулятором и для ENA1.

Интересен тот факт, что клетки S. cerevisiae способны выдерживать заметно большие концентрации Li⁺ в проценссе дыхания на глюкозе, нежели в процессе брожения. Однако, мутанты, утратившие ENA-гены, не только менее устойчивы к повышению концентрации Li⁺, но и отличаются одинаковым уровнем устойчивости как в процессе дыхания, так и при брожении. Подобные результаты позволяют предположить влияние дыхания на какие-то процессы регуляции ENA- генов [72].

4. Кальцинеурин. Как TRK1,2 система поглощения K⁺, так и ENA1/PMR2A система выброса Na⁺, регулируются концентрациями определенных ионов. Поглощение K⁺ определяется изменением сродства Trk1p/Trk2p-системы под влиянием внутриклеточного содержания K⁺. Активность ENA1/PMR2A переносчика индуцируется осмотическим стрессом и высокими значениями рН на уровне транскрипции [75]. Регуляция TRK1,2 и ENA1/PMR2A осуществляется, по меньшей мере частично, кальций-зависимой протеин фосфатазой кальцинеурином, что говорит о потенциальной связи системы Ca²⁺-зависимых сигналов и процессов солеустойчивости [76, 77].

Кальцинеурин - это кальмодулин-зависимая протеин фосфатаза [78]. Он является гетеродимером, состоящим из каталитической субъединицы А (60 кДа), карбоксильный конец которой содержит автоингибирующий домен с Ca²⁺-кальмодулин связывающим участком, и стабильно связанной с ней регуляторной субъединицы В (20 кДа). Кальцинеурин активируется присоединением Са²⁺ к кальмодулину и субъединице В. Са²⁺ связывается с автоингибирующим доменом субъединицы А и активирует фосфатазу [52]. Принцип работы кальцинеурина заключается в дефосфорилировании и, таким образом, активации фактора транскрипции. При адаптации к соли активируется неизвестный пока фактор транскрипции, который повышает экспрессию ENA1/PMR2A, продукт которого необходим для увеличения выброса Na⁺ [52].

У S. cerevisiae были выделены гены, кодирующие субъединицы кальцинеурина и белки, связывающие циклоспорин А [79]. Нуль-мутанты по генам, кодирующим каталитическую субъединицу кальцинеурина (CNA1, CNA2), или по гену CNB1, кодирующему регуляторную субъединицу, полностью утрачивают активность кальцинеурина. Такие мутанты жизнеспособны при довольно широком спектре жизненных условий, но очень чувствительны к средам с повышенным содержанием Na⁺ и Li⁺, а так же к средам со щелочными значениями рН [76, 77]. Подобно этому, обработка дрожжевых клеток циклоспорином А или FK506 (ингибиторами кальцинеурин-зависимой передачи сигналов в активированных Т клетках) вызывает солечувствительность, но только у клеток с неповрежденными иммунодепрессант-связывающими белками. Уменьшение солетолерантности, связанное с потерей активности кальцинеурина, в основном объясняется уменьшением экспрессии ENA1/PMR2A, и, во-вторых, уменьшением сродства белка-переносчика Trk1p к K⁺ при солевом стрессе. Однако мутанты, даже полностью утратившие активность кальцинеурина, сохраняют некоторую способность реагировать на солевой стресс увеличением экспрессии ENA1/PMR2A [52]. Этот факт говорит о наличии нескольких сенсоров, отвечающих на разные составляющие солевого стресса, сигналы от которых могу идти различными путями.

5. Гены группы HAL. Для обнаружения генов, ответственных за постоянство концентрации ионов в клетке, было выделено несколько дрожжевых генов, ответственных за солетолерантность.

HAL1 определяет внутриклеточное Na⁺/K⁺ соотношение с помощью неизвестных механизмов [80]. Этот ген кодирует полярный белок с молекулярным весом около 32 кДа, локализованный в цитоплазме. Экспрессия этого гена возрастает при повышении концентрации NaCl, KСl, или сорбита. Разрушение этого гена ведет к снижению солетолерантности [80]. Можно только делать предположения о механизме солетолерантности, определяемом белком Hal1p. Этот белок не связан с мембранами, не является фактором ядерной транскрипции, он не вызывает увеличения концентрации глицерина в клетке. По-видимому, в клетках со сверхэкспрессией гена HAL1, токсичность натрия подавляется увеличением аккумуляции калия [80]. Наиболее важной особенностью состояния таких клеток при стрессе является низкое Na⁺/K⁺ соотношение, около 0,4, тогда как в нормальных клетках это соотношение при солевом стрессе достигает 1.

Известно, что ферментные системы, ингибируемые NaCl, чувствительны к Na⁺/K⁺ соотношению, и Na⁺ становится токсичным для дрожжей, когда это соотношение превышает 0,5 [63]. Следовательно, в клетках со сверхэкспрессией HAL1 солевая токсичность преодолевается увеличением аккумуляции калия, однако транспортная система, являющаяся мишенью для белка Hal1p и отвечающая за транспорт калия, остается неизвестной, доказано только, что АТФаза Ena1p не принимает в этом участия [81].

Помимо аккумуляции калия, сверхэкспрессия HAL1 вызывает увеличение экспресии ENA1 (как при нормальных условиях, так и в условиях солевого стресса), что ведет к увеличению выброса натрия из клетки [75].

Индукция HAL1 независима от кальцинеурина или пути через белок Hog1p, как это показано для некоторых других генов [76, 82]. С другой стороны, экспрессия HAL1 негативно контролируется ПКА, основным модулятором стрессорных ответов.

У дрожжей S. cerevisiae обнаружен ген HAL2, сверхэкспрессия которого повышает устойчивость дрожжевых клеток к повышенным концентрациям Na⁺ и Li⁺. Сравнительный анализ показал, что HAL2 идентичен MET22, гену, вовлеченному в синтез метионина. Последнее предполагает, что одна из ступеней синтеза метионина является чувствительной к литию и натрию [83].

Белок Hal2p имеет гомологию с инозитолфосфатазой (К.Ф. 3.1.3.25), ферментом, чувствительным к ингибированию солями лития, но таковой не является [84, 85].

Недавно было показано, что ген HAL2 кодирует 3’(2’)5’-бисфосфат нуклеотидазу, которая специфически дефосфорилирует 3’фосфоаденозин-5’ фосфат (PAP) - конечный продукт пути ассимиляции сульфата.

Сверхэкспрессия гена HAL3 повышает устойчивость к солевому стрессу у дикого типа клеток S. cerevisiae, и подавляет солечувствительность кальцинеуриновых мутантов [52]. Гомолог этого гена - CtHAL3 обнаружен у Candida tropicales [86]. Белок Hal3p способствует адаптации к NaCl, одновременно повышая поглощение K⁺ и выброс из клетки Na⁺ [75].

Мутанты, утратившие белок Hal3p или кальцинеурин характеризуются меньшим уровнем солезависимой экспрессии ENA1/PMR2A, чем клетки дикого типа, а двойные мутанты проявляют еще меньший уровень транскрипционного ответа.

Вне зависимости от стимуляции выброса Na⁺, белок Hal3p повышает солеустойчивость путем активации поглощения K⁺. Физиологические исследования показали, что кальцинеурин и белок Hal3p могут функционировать в отсутствие друг друга, обеспечивая тем самым функционирование двух параллельных и независимых путей, ответственных за поддержание гомеостаза клетки в стрессовых условиях. Однако не исключено, что белок Hal3p является одной из двух или более избыточных мишеней для кальцинеурина [52].

6. Hатрий/протон-антипортер и АТФаза плазматической мембраны. Осмотическое давление, вызываемое NaCl в концентрации до 1М, Z. rouxii компенсируют за счет синтеза глицерина, который подавляется концентрациями соли более 2 М, и клетка компенсирует осмотическое давление за счет неорганических ионов - Na⁺, Cl^-, K⁺, причем, чем выше концентрация NaCl в среде, тем больше относительное содержание ионов в общем количестве осмотически активных соединений [4, 87].

Для обеспечения выживания в условиях солевого стресса, дрожжи не должны допускать значительного повышения уровня внутриклеточного Na⁺. Это достигается различными механизмами, к которым можно отнести натриевую АТФазу. АТФаза подобного типа обнаружена у S. cerevisiae [58]. Однако АТФазы солеустойчивых дрожжей Z. rouxii [88] и Candida versatilis [89] не обнаруживают подобной активности, работая как протонные АТФазы.

У Sch. pombe внутриклеточная концентрация натрия регулируется Na⁺/H^+-антипортером, который кодируется геном SOD2 [90]. Штаммы со сверхэкспрессией этого обменника отличаются большей толерантностью к повышенным концентрациям Na⁺ и Li⁺. При рН более 6, штаммы, дефектные по SOD2, расти не могут; отсюда следует, что этот антипортер играет роль в регуляции рН [91].

В настоящее время выделен и клонирован ген Na⁺/H⁺-антипортера у S. cerevisiae, названный NHA1 ген (2958 нуклеотидов), продукт которого показывает большую степень гомологии с соответствующими белками Sch. pombe и Z. rouxii [92].

Инкубация клеток, имеющих сверхэкспрессию Na⁺/H⁺-антипортера, с 150 мM NaCl приводила к немедленному закислению среды, снятие солевого стресса - к защелачиванию, тогда как инкубация sod2-мутантов не приводила к подобнм результатам. Последнее указывает на то, что антипортер может работать в двух направлениях: экспортируя и импортируя протон в зависимости от наружной концентрации натрия [91].

Для выяснения зависимости солеустойчивости Z. rouxii от работы Na⁺/H⁺-антипортера, был выделен ген, имеющий гомологию с геном Na⁺/H⁺-антипортера Sch. pombe (SOD2) [93, 94]. Новоизолированный ген (Z-SOD2) кодирует белок, содержащий 791 аминокислоту. Клетки с разрушенным геном Z-SOD2 не способны расти на среде с 3М NaCl, но хорошо растут на среде с 50%-ным сорбитом, что говорит о том что функция продукта Z-SOD2 тесно связана с солеустойчивостью Z. rouxii. Более того, когда протонный градиент, образующийся при работе АТФазы плазматической мембраны, исчезает при добавлении в среду низких концентраций протонного ионофора или ингибитора протонной АТФазы, клетки Z. rouxii теряют способность расти при высоких концентрациях NaCl, но остаются нечувствительными к высоким концентрациям сорбита [93]. Это явление можно объяснить тем, что Na⁺/H⁺-антипортер определяет выброс из клетки ионов натрия, используя протонный градиент, как движущую силу. Такой процесс характерен для S. cerevisiae [95].

Схематически механизм для поддержания низкого уровня ионов Na⁺ в условиях солевого стресса у дрожжей Z. rouxii может быть представлен следующим образом. Немедленно после начала солевого стресса ионы Na⁺ начинают проникать в клетку через Na⁺/H⁺-антипортер, в обмен на выходящий из клетки протон. Недавно было показано, что у Z. rouxii после начала солевого стресса резко возрастает уровень цАМФ, который непосредственно вызывает активацию АТФазы [96]. Концентрация цАМФ в клетке возрастает в течение 10 мин [97], а затем снижается [73]. Этот процесс активирует работу АТФазы клеточной мембраны, причем активация достигает максимума через 5 мин после начала солевого стресса. АТФаза плазматической мембраны, активированная солевым стрессом, выбрасывает протоны из клетки, вызывая подщелачивание цитоплазмы и одновременное падение рН внешней среды. Возможно, что повышение рН цитоплазмы запускает многие процессы солевой адаптации. АТФаза создает трансмембранный протонный градиент, котрый стимулирует повторное поступление протонов в клетку и выброс из клетки ионов Na⁺ через Na⁺/H⁺-антипортер [98]. Активность протонной АТФазы Z. rouxii также возрастает в присутствии NaCl [98].

Те же самые особенности характерны для протонной АТФазы солетустойчивых дрожжей Candida versatilis: АТФаза стимулируется добавлением NaCl, независимо от фазы роста [89].

Таким образом, условия солевого стресса активируют протонную АТФазу, обеспечивая выброс протонов из клетки, который не ингибируется амилоридом, специфическим ингибитором Na⁺/H⁺-антипортера [98].

Белки стрессового ответа

Ген СТТ1, кодирующий цитозольную каталазу Т, является одной из мишеней пути через белок Hog1p. Он индуцируется при повышении концентрации соли в среде, а инактивация протеинкиназкиназ, кодируемых генами HOG1 или PBS2 приводит к понижению содержания CTT1 мРНК в клетке в условиях солевого стресса [82, 99, 100].

Обнаружен белковый фактор с молекулярной массой около 140 кДа, который способен связываться со ЦЦЦЦТ-элементом в промоторе гена СТТ1.

Другие гены, активируемые при осмотическом стрессе, кодируют белки теплового шока Hsp26p и Hsp12p. Хотя их функции остаются до конца не выясненными, но отмеченно массированное накопление обоих белков при тепловом и осмотическом стрессе [101], в присутствии этанола, Н₂О₂, истощении среды по глюкозе, достижении культурой стационарной фазы роста, а так же у мутантов с поврежденной аденилат циклазой [2].

Эта комплексная модель экспрессии и необычная сила промотора позволяют картировать цис-активирующие элементы и анализировать распределение ролей различных путей передачи сигналов в регуляции этих генов [13, 82].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В живой природе существует целый ряд экосистем, характеризующихся высоким засолением [1]. Целые географические районы вынуждены вести сельское хозяйство в условиях неизменного солевого стресса, что не может не сказываться на состоянии выращиваемых культур. Именно поэтому большое прикладное значение имеет изучение процессов адаптации метаболизма растений к солевому стрессу. Однако, при исследовании адаптационных механизмов на уровне целого растения возникает ряд трудностей, связанных с тем, что растительный организм является слишком многофакторной системой, чтобы проследить индивидуальные эффекты воздействия повышенной концентрации соли. С другой стороны, культура растительных клеток обладает высокой нестабильностью, хрупкостью по отношению к стрессовым воздействиям. В связи с вышеизложенным, наиболее оптимальным является вариант с использованием солеустойчивых видов дрожжей в качестве модельной системы для изучения воздействия солевого стресса на метаболизм. Механизмы адаптации растений и дрожжей к стрессу могут несколько отличаться, но общие их закономерности показывают значительное сходство.

Во-первых, клеточный ответ включает в себя как изменение активности ряда ферментов, так и индукцию экспрессии некоторых генов. Во-вторых, повышение засоления среды ведет как к потере клеткой тургора за счет повышения осмотического давления внешней среды, так и к ингибированию некоторых ферментных систем высокими концентрациями ионов Na⁺, и организм вынужден перестраиваться для компенсации этих эффектов.

Наибольшее внимание в настоящее время сосредоточено на проблеме изучения путей передачи в клетке стрессовых сигналов. Сигнал об изменении осмотического давления внешней среды передается по АМП-киназному каскаду, основной мишенью которого является ЦЦЦЦТ-последовательность промотора ряда генов [10, 11].

Дрожжи в ответ на повышение осмотического давления среды (вызываемого в том числе и солевым стрессом) накапливают внутриклеточно природный осмотик - глицерин [34]. Это происходит за счет увеличения синтеза, а так же за счет повышения его накопления внутри клетки. У S. cerevisiae за повышение синтеза глицерина отвечает цитоплазматическая НАД-ГФДГ, кодируемая ядерным геном GPD1 [26]. Промотор этого гена содержит ЦЦЦЦТ-последовательность, и его экспрессия регулируется посредством АМП-киназного каскада через Hog1р [12]. У Z. rouxii, скорее всего, преобладает альтернативный путь синтеза глицерина через глицеролдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.6) от дигидроксиацетона [30]. Увеличение аккумуляции глицерина происходит за счет уменьшения его утечки через плазматическую мембрану при закрытии каналов облегченной диффузии [35], а так же за счет активного транспорта присутствующего в среде глицерина, который характерен для солетолерантных видов дрожжей Z. rouxii [32], D. hansenii, и P. sorbitophila [41].

В адаптации клеток дрожжей Z. rouxii к солевому стрессу большую роль играет изменение липидного состава клеточной мембраны, особенно увеличение количества фосфолипидов с высоким содержанием насыщенных жирных кислот [46], что понижает текучесть мембран. Но такое явление не характерно для S. cerevisiae - солечувствительного вида дрожжей [49]. Вместо этого, S. cerevisiae уменьшают текучесть мембраны за счет увеличения длины цепей жирных кислот в фосфолипидах [50]. Вышеуказанные адаптивные механизмы способствуют уменьшению утечки глицерина из клетки и частично препятствуют проникновению в клетку ионов Na⁺, токсичных для ряда процессов метаболизма.

Для обеспечения выживания в условиях солевого стресса, дрожжи не должны допускать значительного повышения уровня внутриклеточного Na⁺. Это достигается различными механизмами, к которым можно отнести натриевую АТФазу. АТФаза подобного типа обнаружена у S. cerevisiae [58], она кодируется геном ENA1/PMR2 [73]. Индукция ENA1 при солевом стрессе осуществляется с помощью двух различных путей передачи сигналов: АМП-киназного каскада через белок Hog1p, который контролирует экспрессию при низких концентрациях NaCl, и кальцинеуринового пути, отвечающего за индукцию при высоких концентрациях NaCl. Эти два пути отвечают на различные сигналы, связанные с солевым стрессом. Тогда как путь через белок Hog1p реагирует на неспецифический осмотический шок [11], кальцинеурин-зависимая индукция может запускаться только NaCl, но не KCl или сорбитом [73].

Однако АТФазы солетолерантных дрожжей Z. rouxii [88], C. versatilis [89] не обнаруживают подобной активности, работая как протонные АТФазы. Образуемый протонный градиент может использоваться как движущая сила вторичных транспортных механизмов, как это показано для S. cerevisiae [57], таким образом, при кислых значениях рН Na⁺ может выводиться с помощью Н⁺/катион антипортеров [74]. Такой механизм выброса Na⁺ показан для Sch. pombe [90], Z. rouxii [93, 94], C. versatilis [89].

Представленные данные не исчерпывают всего многообразия информации, связанной с проблемой выживания клетки в условиях солевого стресса, однако позволяют получить общие представления об адаптивных механизмах, работающих в данных условиях.

Ðàáîòà áûëà ïîääåðæàíà Ðîññèéñêèì Ôîíäîì Ôóíäàìåíòàëüíûõ Èññëåäîâàíèé, ãðàíò N 97-04-49464.

ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ

1. Galinski, E.A., Truper, H.G. // FEMS Microbiol Rew. 1994. V. 15. ¹ 2-3. P. 95-108.

2. Mager W.H., De Kruijff A.J.J. // Microbiol. Rew. 1995. V. 59. ¹ 3. P. 506-531.

3. Matsutani K., Kukuda Y., Murata K., Kimura A., Yajima N. // J. Ferment. Bioenerg. 1992. V. 73. ¹ 3. P. 228-229.

4. Yagi T., Nishi T. // Microbios. 1993. V. 74. ¹ 298. P. 155-166.

5. Maeda T., Wurgler-Murphy S.M., Saito H. // Nature. 1994. V. 369. ¹ 6477. P. 242-244.

6. Possas F., Wurgler-Murphy S.M., Maeda T., Witten E.A., Thai T.C., Saito H. // Cell. 1996. V. 86. ¹ 6. P. 865-875.

7. Maeda T.F, Takekawa M. // Science. 1995. V. 269. ¹ 5223. P. 554-558.

8. Yu G., Deschenes R.J., Fasses J.S. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. ¹ 15. P. 8739-8743.

9. Hohmann S., Albertin J. // Yeast. 1995. V. 11. (sp.iss.) Ð. 360.

10. Gustin M.C., Davenport K., Sohaskey M. // Yeast. 1995. V. 11. (sp. iss.) Ð. 17.

11. Brewster J.L., de Valoir T., Dwyer N.D., Winter E., Gustin M.C. // Science. 1993. V. 259. ¹ 5102. Ð. 1760-1763.

12. Ruis H. // Yeast. 1995. V. 11. (sp. iss.) Ð. 21.

13. Marchler G. // Yeast. 1995. V. 11. (sp.iss.) Ð. 222.

14. Nishi T., Yagi T. // 1993. J. Gen. Appl. Microbiol. V. 39. ¹ 5. P. 493-505.

15. Thevelein J.M. // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. ¹ 6. P. 1301-1307.

16. Gilman A.G. // Cell. 1984. V. 36. ¹ 3. P. 577-579.

17. Vilela C., Saude L., Bosseir P., Rodriguez-Pousada Ñ. // Yeast. 1995. V. 11. (sp. iss.) Ð. 376.

18. Boguslawski G. // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. ¹ 5. P. 2425-2432.

19. Varela J.C.S., Praekelt U.M., Meacock P.A., Planta R.J., Mager W.H. // Mol. Cel. Biol. 1995. V. 15. ¹ 11. P. 6232-6245.

20. Bellinger Y., Larher F. // Sciences des Aliments. 1991. V. 11. ¹ 1. P. 37-48.

21. Khaware P.K., Jethwaney D., Prasad R. // Biochem. Mol. Biol. International. 1996. V. 39. ¹ 2. P. 421-429.

22. Hernandes-Saavedra N.Y., Ochoa J.L., Varques-Duhalt R. // Microbios. 1995. V. 80. ¹ 323. P. 99-106.

23. Nakata K., Hasegawa J., Okamura K. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. ¹ 6. P. 986-989.

24. Aiba H., Yamada H., Ohmiya R., Mizuno T. // FEBS Lett. 1996. V. 376. ¹ 1. P. 199-201.

25. Ohmiya R., Aiba H., Yamada H., Mizuno T. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. ¹ 2. P. 553-555.

26. Albertyn, J., van Tonder, A., Prior B.A., Bernard A. // FEBS Letters. 1992. V. 308. ¹ 2. P. 130-132.

27. Nilsson A., Adler L. // Biochem. Biophys. Acta. 1990. V. 1034. ¹ 2. P. 180-185.

28. Ohmiya R., Yamada H., Nakashima K., Aiba H., Mizuno T. // Mol. Microbiol. 1996. V. 18. ¹ 5. P. 963-973.

29. Yamada H., Ohmiya R., Aiba H. // Biosci. Biotehnol. Biochem. 1996. V. 60. ¹ 5. P. 918-920.

30. Ohshiro K., Yagi T. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1996. V. 42. ¹ 3. P. 201-212.

31. Larsson C., Morales C., Gustafson L. Adler L.. // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 4. P. 1769-1774.

32. Van Zyl P.J., Kilian S.J., Prior B.A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 34. ¹ 3. P. 231-235.

33. Lages F., Neves L., Lucas C. // Yeast. 1995. V. 11. (sp.iss.) Ð. 444.

34. Albertyn J., Hohmann S., Prior B.A. // Yeast. 1995. V. 11. (sp. iss.) Ð. 347.

35. Van Aelst L., Hohmann S., Ziìmermann F.K., Jans A.W.H., Thevelin J.M. // EMBO J. 1991. V. 10. ¹ 8. P. 2095-2104.

36. Luyten K., Albertyn J., Skibbe W.F., Prior B.A., Ramos J., Thevelin J.M., Hohmann S. // Yeast. 1995. V. 11. (sp. iss.) Ð. 447.

37. Gaxiola R., Corona M., Zinker S. // J. Bacteriol. 1996. V. 178. ¹ 10. P. 2978-2981.

38. Matsutani K., Kukuda Y., Murata K., Kimura A., Yajima N. // J. Ferment. Bioenerg. 1992. V. 73. ¹ 3. P. 228-229.

39. Omori T., Ogawa K., Shimoda M. // J. Ferment. Bioenerg. 1995. V. 79. ¹ 6. P. 560-565.

40. Prista C., Alm