Черных Е.Р., зав. лаб., д.м.н., профессор

2.Останин А.А., в.н.с., д.м.н., проф.

3. Хонина Н.А., с.н.с., д.м.н.

4. Леплина О.Ю., с.н.с., к.м.н.

5. Шевела Е.Я., с.н.с., к.м.н.

6. Сахно Л.В., с.н.с., к.б.н.

7. Тихонова М.А., с.н.с., к.б.н.

8. Баторов Е.В., м.н.с., к.м.н.

9. Тыринова Т.В., м.н.с., к.м.н.

10. Сергеевичева В.В., н.с., к.м.н.

13. Смирнова В.Ф., Лаб-иссл.

14. Мяснянкина Т.А., лаб-иссл.

15. Кащенко Т.М., лаб-иссл.

16. Борисенкова Н.И., лаб-иссл.

17. Сычева Н.В., н.с. (0,5 ставки)

18. Орловская И.А., д.м.н., профессор, зав. лаб.

19. Цырендоржиев Д.Д., в.н.с., д.м.н., профессор

20. Топоркова Л.Б., с.н.с, к.б.н.

21. Е.А. Вязоваяб м.н.с., к.б.н.

22. Басова А.А., к.б.н.,

23. Феофанова Н.А., к.б.н.

Объект исследования: здоровые доноры, пациенты с гемобластозами, хроническими вирусными инфекциями, пострадавшие от черепномозговой травмы, больные аутоиммунными заболеваниями и заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), мыши (CBAxC57Bl/6-F1, Balb/c, Agouty yellow). Модели: экспериментальный коллаген-индуцированный артрит, ДНХБ-индуцированный контактный дерматит, СCl4-индуцированный гепатит.

Методы исследования:

Для решения поставленных задач будут использованы методы культивирования клеток, проточной цитофлюоримтерии, радиометрический метод оценки пролиферативной активности, метод протеомного анализа и ИФА для оценки продукции цитокинов.

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) буду генерироваться из МНК костного мозга, М1 и М2-подобные макрофаги из прилипающей фракции МНК периферической крови. Иммуносупрессорная и иммуностмулирующая активность МСК будет оцениваться по подавлению или стимуляции пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов с использованием Н3-тимидина. Фагоцитарная активность МСК будет изучаться по способности МСК поглощать апоптотические клетки. Функциональная активность М2-подобных макрофагов будет исследована по способности этих клеток стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток в СКЛ и продукции цитокинов. Клинические испытания М2-подобных макрофагов будут проведены у пациентов с нейропатологией (ДЦП и церебральным инсультом). Гемопоэтические и эндотелиальные предшественники будут оцениваться методом цитофлюориметрии по количеству CD45+CD34+ клеток и CD3-CD34+CD144+ клеток с использованием соответствующих моноклональных антител (BD PharMingen, США).

Исследования у животных будут включатьподсчет количества клеток периферической крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты) с помощью гематологического анализатора PCE-90 (ERMA Inc., Япония), оценку количества коммитированных гемопоэтических предшественников в метилцеллюлозной среде, определение количества селезеночных колониеобразующих единиц (в т.ч. метод «тимидинового самоубийства), оценку интенсивности мобилизации гемопоэтических предшественников из костного мозга в периферическую кровь (количество КОЕс в крови), оценку окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и мононуклеарных клеток с помощью хемилюминесценцентного (ХЛ) метода, оценку миграции лейкоцитов из кожного эксплантата по методу Larsen, оценку активности металлопротеиназ-2, 9 (ММП-2,9) (зимографический анализ), методы определения компонентов внеклеточного матрикса в сыворотке крови, гистологические методы исследования и др.

Аппаратура и оборудование:

Предполагается использование проточного цитофлюориметра FACS Calibur, клеточного сортера FACS Aria, проточного анализатора Bio-Plex Protein Assay System, СО2-инкубатора, морозильной камеры, программного замораживателя, многоканального спектрофотометра, а также традиционного лабораторного оборудования (ламинарные боксы, термостаты, холодильники, центрифуги, микроскопы, дозаторы и пр.)

Научная новизна:

Будут получены новые данные о регуляции функциональной активности МСК в норме и при патологии. Впервые будет детально изучена зависимость функциональной активности МСК (супрессорной/стимуляторной, гемопоэзстимулирующей и др.) от уровня пролиферативной активности МСК. Будут охарактеризованы механизмы влияния МСК на восстановление лимфо/иммунопоэза у больных гемобластозами при проведении трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток. Будут получены новые данные о свойствах и эффективности М2-подобных макрофагов при заболеваниях ЦНС у человека.

Исследование циркулирующих гемопоэтических и эндотелиальных предшественников при травматическом повреждении головного мозга позволит впервые охарактеризовать эффективность мобилизации костно-мозговых предшественников у пациентов с различными исходами ЧМТ и оценить роль мобилизации стволовых клеток как потенциального прогностического маркера эндогенного репаративного ответа при травме головного мозга. В свою очередь, анализ субпопуляционного состава и функциональной активности клеток продукта сепарации, а также реконституции регуляторных Т-клеток в посттрансплантационном периоде позволит получить новые данные о роли различных иммунокомпетентных и стволовых клеток в восстановлении иммунной системы и исходах трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами.

В результате выполнения экспериментальных исследований на животных будут получены новые данные о состоянии костномозгового гемопоэза, функциональной активности стволовой кроветворной клетки в динамике формирования коллаген-индуцированного артрита, контактного дерматита, острого и хронического гепатита.

Ожидаемые результаты:

Исследование влияния различных факторов на регуляторную активность МСК позволит более детально охарактеризовать феномен функциональной дихотомии МСК в норме и при патологии. При этом анализ взаимосвязи пролиферативной активности МСК с их регуляторными функциями и миграционной активностью послужит основой для более глубокого понимания возможных механизмов нарушения функциональной активности МСК при патологии и разработке подходе к коррекции их функций. Анализ влияния МСК на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов и восстановление наивных Т-клеток (в посттрансплантационном периоде у больных гемобластозами) позволит оценить эффект МСК in vivo на иммунную реконституцию в условиях глубокой цитопении и раскрыть механизмы стимулирующего действия МСК на восстановление наивных Т-клеток при проведении трансплантации гемопоэтических стволовых клеток больным гемоблатозами. Исследование особенностей фенотипа М1 и М2 макрофагов послужит основой для идентификации М2-ассоциированных маркеров у человека. При этом клиническая апробация М2 макрофагов при заболеваниях ЦНС позволит оценить безопасность и переносимость данного типа клеток и сделать предварительные заключения об их эффективности в стимуляции репаративных процессов.

Выявление новых молекулярных и клеточных маркеров, характеризующихся диагностической и прогностической значимостью, с одной стороны позволит разработать новые методы прогноза исходов различных иммунопатологических состояний и эффективности их лечения, а с другой - идентифицировать новые потенциальные мишени для терапевтических воздействий.

Проведенные на экспериментальных животных исследования состояния костномозгового гемопоэза, функциональной активности стволовой кроветворной клетки в динамике формирования коллаген-индуцированного артрита, контактного дерматита, острого и хронического гепатита позволят разработать новые технологии лечения ревматоидного артрита, контактного дерматита с помощью TNF-связывающих белков ВНО и ДНК-вакцины на основе гена ВНО, острого гепатита и гепатофиброза - с использованием метода трансплантации мезенхимальных клеток. В результате исследования будет обоснована новая биомедицинская технология трансдермальной доставки TNF и его блокаторов для терапевтических целей.

Взаимодействие с другими НИУ, вузами, клиниками:

ФГУ НИИТО Минздравсоцразвития, ИЦиГ СО РАН

Смета: 80 млн. руб.

Научно-медицинская литература

	Korbling M, Estrov Z. Adult stem cells for tissue repair - a new therapeutic concept? //N Engl J Med.- 2003.-Vol.349(6).-P.570-82.
	Anderson D.J., Gage F.H., Weissman I.L.// Can stem cells cross lineage boundaries? Nat Med.- 2001.-Vol.7.-P.393-5.
	Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats.// J Neurol Sci.- 2001.-Vol. 18.-P. 49–57.
	Ohtaki H, Ylostalo JH, Foraker JE, Robinson AP, Reger RL, Shioda S, et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/ immune responses.// Proc Natl Acad Sci USA.- 2008.- Vol. 105.-P. 14638–43.
	Liu H, Honmou O, Harada K, Nakamura K, Houkin K, Hamada H, et al. Neuroprotection by PlGF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia.// Brain.- 2006.-Vol.129.-P. 2734–45.
	Sergeevicheva V.V., Shevela E.Y., Sizikova S.A., Kulagin A.D., Kruchkova I.V., Gilevich A,V., Lisukov I.A., Kozlov V.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastoses patients efficiently support hematopoietic recovery stem cell transplantation // Cellular therapy and transplantation. – 2010. – V.1, №4. – P. 98-105.
	Шевела Е.Я., Кулагин А.Д., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Крючкова И.В., Орловская И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Апластическая анемия: фенотип и функции мезенхимальных стромальных клеток костного мозга // Гематология и трансфузиология.- 2010.- Т. , № 6.- С. 14-21.
	Шевела Е.Я., Петровский Я.Л., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Сергеевичева В.В., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология.- 2008.- № 2.- С. 32-38
	Chernykh E.R., Shevela E.Ya., Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Petrovsky Ya.L., Ostanin A.A. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? // Cellular Therapy and Transplantation.- 2010.- Vol. 2, N 6.
	Waterman R.S., Tomchuck S.L., Henkle S.L., Betancourt A.M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an immunosuppressive MSC2 phenotype // PloS ONE. – 2010. – Vol. 5, n. 4: e10088. - doi:10.1371.
	Viswanathan S. and Keating A. Mesenchymal Stromal Cells: Latest Advances // Tissue Engineering in Regenerative Medicine. - Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Part 1. – 2011. – P. 53-74.
	Wojakowski W., Tendera M., Zebzda A., Michalowska A., Majka M., Kucia M., Maslankiewicz K., Wyderka R., Król M., Ochala A., Kozakiewicz K., Ratajczak M.Z. Mobilization of CD34+, CD117+, CXCR4+, c-met+ stem cells is correlated with left ventricular ejection fraction and plasma NT-proBNP levels in patients with acute myocardial infarction // Eur Heart J.- 2006.-Vol. 27.-P.:283-289
	Yamada M, Kubo H, Ishizawa K, Kobayashi S, Shinkawa M, Sasaki H. Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia: evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair.// Thorax.- 2005.-Vol.60.-P.410–413.
	Rafat N, Hanusch C, Brinkkoetter PT, Schulte J, Brade J, Zijlstra JG, Woude FJ van der, van Ackern K, Yard BA, Beck G. Increased circulating endothelial progenitor cells in septic patients: correlation with survival. // Crit Care Med.- 2007.-Vol.35.-P.1677–1684.
	Sobrino T., Hurtado O., Moro M. A., et al. The increase of circulating endothelial progenitor cells after acute ischemic stroke is associated with good outcome. //Stroke.- 2007.-Vol. 38.-P. 2759-64.
	Werner C., Engelhard K. Pathophysiology of traumatic brain injury// Br. J. Anaesth.-2007.- Vol.99,N (1).-P.4-9.
	Griffiths M. R., Gasque P.,. Neal J.W. The Regulation of the CNS Innate Immune Response Is Vital for the Restoration of Tissue Homeostasis (Repair) after Acute Brain Injury: A Brief Review // Int.J. of Inflam..- 2010 Aug 9;2010:151097, 18 pages doi:10.4061/2010/151097
	Gordan L.N., Sugrue M.W., Lynch J.W., et al. Correlation of early lymphocyte recovery and progression-free survival after autologous stem-cell transplant in patients with Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma // Bone Marrow Transplant.- 2003.- Vol. 31.- P. 1009-1013.
	Nadal E., Garin M., Kaeda J. et al. Increased frequencies of CD4+CD25high Tregs correlate with disease relapse after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia // Leukemia.- 2007.- № 21.- P. 472–479.
	Гилева И.П., Непомнящих Т.С., Рязанкин И.А., Щелкунов С.Н. Рекомбинантный TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы как потенциальный TNF-антагонист нового поколения // Биохимия. 2009. 74(12). 1664 – 1671
	Cordiali-Fei P., Trento E., D'Agosto G., Bordignon V., Mussia L., Ardigo M., Mastroianni A., Vento A., Solivetti F., Berardesca E., Ensoli F., 2007, Effective therapy with anti-TNF- in patients with psoriatic arthritis is associated with decreased levels of metalloproteinases and angiogenic cytokines in the sera and skin lesions, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1110, 578–589.
	Kirou K. A., Mavragani C. P. TNF antagonists in the management of early rheumatoid ar-thritis: an overview // Int J. Adv. Rheumatol. – 2006; 4: 49–56.
	Larsen, C.P., Steinman, R.M., Witmer-Pack, M., Hankins, D.F., Morris, P.J., Austyn, J.M. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants // J. Exp. Med.- 1990.- vol. 172.- P.1483-1493.
	Papadaki H., Kritikos H., Valatas V., Boumpas D., Eliopoulos G. . Anemia of chronic diseases in rheumatoid arthritis is associated with increased apoptosis of bone marrow erythroid cells: improvement following anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy // Blood. – 2002. - Vol. 100. - P. 474-482.
	Redlich K., Schett G., Sterner G. et al. Rheumatoid arthritis therapy after tumor necrosis factor and interleukin-1 blockade // Arthritis Rheum. – 2003. – Vol.48. – P. 3108-3119.
	Rusten L.S., Jacobsen S.E. Tumor necrosis factor (TNF)-alpha directly inhibits human erythropoiesis in vitro: role of p55 and p75 TNF receptors // Blood. – 1995. – Vol. 85. – P. 989-996.
	Seth Rivera, Tomas Ganz. Animal Models of Anemia of Inflammation. Semin Hematol. 2009. 46(4): 351–357.

Аннотация

Целью исследования является разработка методологии, а также способов прогноза и оценки эффективности применения стволовых и иммунокомпетентных клеток для иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов при различных иммунопатологических состояниях. В работе планируется разработать и апробировать технологии стимуляции репаративных процессов с использованием мезенхиальных стромальных клеток и макрофагов при лечении гемобластозов и ряда негематологических заболеваний; изучить прогностическую значимость прогениторных/иммунокомпетентных клеток как предикторов эндогенного регенеративного ответа и эффективности клеточных технологий; а также исследовать патогенетическую роль предшественников и разработать подходы к направленной регуляции функций стволовых/прогениторных клеток в моделях иммунопатологических состояний на животных. Полученные результаты позволят обосновать применение новых клеточных технологий и повысить эффективность лечения иммунопатологических заболеваний.