Етод гибридизационного анализа.

Метод гибридизационного анализа, также используемый для детекции ПЦР продуктов, является более объективным, т.к. интерпертация полученных результатов может проводиться в атоматическом режиме при наличии специального программного обеспечения. Однако применение этого метода, также как и электрофореза, невозможна без проведения всех организационно-методических мероприятий, направленных на предупреждение возможной контаминации биологических образцов.

3. ПЦР в режиме реального времени (Реал-тайм ПЦР).

В последние годы интенсивно развивается новый подход к проведению ПЦР и детекции продутов амплификации, позволяющий повысить специфичность и чувствительность реакции, а также проводить не только качественную, но и количественную оценку реакции – Реал-тайм ПЦР. Сегодня метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации становится одним из наиболее популярных методов как в клинической генодиагностике, так и в научных исследованиях.

Реал-тайм ПЦР – это метод количественной ПЦР со следующими чертами:

1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.

2. Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР.

3. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Сущность метода заключается в детекции накопления флюоресценции реакционной смеси, при этом интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР. Важнейшей особенностью метода является синхронизация регистрации и амплификации, что дает возможность оценить кинетику процесса, которая зависит от начального количества исследуемого наследственного материала.

Для того чтобы полностью исключить ложноположительные сигналы, связанные с накоплением в процессе ПЦР побочных продуктов амплификации (праймеры-димеры, неспецифические полосы и шмеры), используется построение так называемых кривых плавления для определения температур денатурации, получаемых в ходе реакции продуктов амплификации. Зная температуры плавления продуктов амплификации, синтезировавшихся в данном эксперименте, и температуру плавления специфических ампликонов, можно сделать точный вывод о присутствии исследуемой ДНК в анализируемой пробе.

Для детекции ПЦР-продукта используются флюоресцентные красители, обеспечивающие флюоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта – репортерную флюоресценцию.

Кинетическая кривая ПЦР в координатах «уровень репортерной флюоресценции – цикл амплификации» имеет сигмоидную форму (Рис.3).

В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации, при которой ПЦР-продукты еще не детектируются флюоресцентной меткой.

2. Эскпоненциальную стадию, в которую наблюдается экспоненциальная зависимость количества флюоресценции от цикла ПЦР.

3. Плато – стадию насыщения.

Рис.3. – Кинетические кривые накопления продуктов амплификации в ходе ПЦР в реальном времени при выявлении ДНК Ureaplasma urealuticum в соскобах эпителиальных клеток.

По ординате интенсивность флюоресценции (I_фл), по абсциссе номер цикла амплификации.

Для детекции продуктов амплификации используется несколько подходов:

1. Детекция специфического продукта амплификации с использованием меченых флюоресцентными агентами олигонуклеотидных комплементарных участку ПЦР-продукта.

Меченые олигонуклеотидные пробы используют в технологиях:

· TaqMan PCR – выщепление 5’концевой метки – основан на использовании 5’-экзонуклеазной активности полимеразы.

· Molecular Beacons – использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями.

· В методике Light Cycler – применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии.

2. Детекция всех продуктов амплификации – применение интеркалирующих флюоресцентных агентов.

Преимущества Реал-тайм ПЦР:

ü возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации;

ü отсутствие стадии электрофореза;

ü автоматическая регистрация и интерпретация результатов;

ü количественное определение нуклеиновых кислот в каждой пробе;

ü параллельная детекция до4-х инфекций в одном образце.

Преимущества Реал-тайм ПЦР по сравнению с культуральными методами исследования:

w определение концентрации возбудителя, выраженное в числе бактериальных клеток/мл, а не в условных единицах (ЦИЕ);

w не зависит от падения титра жизнеспособных возбудителей в процессе хранения и транспортировке материала;

w универсальность методики, может сочетаться с исследованиями на другие возбудители;

w отсутствие необходимости в повторном заборе материала.

Задание 3.

Изучите принцип метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК.

Он применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения.

Принцип метода – заключается в способности двунитевой ДНК при повышенной температуре (90°С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°С вновь восстанавливать исходную двунитевую структуру.

Метод требует наличия молекулярного радиоактивного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радионуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в последнем ДНК микроба без выделения этого микроба в чистую культуру. Для осуществления этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, а наличие возбудителя определяют по обнаружению в выделенной ДНК специфичного для искомого микроба гена.

Полимеразная цепная реакция с использованием метода молекулярной гибридизации состоит из 4-х стадий:

1. Денатурация ДНК.

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд.

Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль.

2. Связывание праймеров с комплементарными участками гена, образование репликативной вилки.

Добавляют праймеры, комплементарные З'-концам ДНК искомого гена. Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками.

3. Добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов, синтез гена.

Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена.

4. Повторение цикла.

После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза.

Реакцию проводят в специальных приборах — амплификаторах.