И образуемых в биотехнологических процессах продуктов (по Виестур и др., 1987)
Субстраты Биологические агенты Продукты
Меласса, сок сахарного тро-
стника, гидролизаты расти-
тельных полимеров.
Микроорганизмы, расти-
тельные и животные клетки,
в том числе потической ин-
женерии.
Биоудобрения и биоинсекти-
циды, микробные биомассы,
диагностикумы, вакцины.
Сахара, спирты,
органические кислоты.
Парафины нефти.
Полупродукты,
предшественники
биотрансформации.
Природный газ,
водород.
Отходы с/х и лесной
промышленности.
Отходы промышленности,
в том числе переработки
фруктов и овощей.
Бытовые отходы,
сточные воды.
Молочная сыворотка.
Картофель, зерно.
Зеленая биомасса растений.
Вирусы.
Компоненты клеток:
мембраны, протопласты,
митохондрии, ферменты.
Внеклеточные продукты:
ферменты, коферменты.
Иммобилизованные клетки
микроорганизмов, растений
и животных, их компоненты
и внеклеточные продукты.
Биогаз.
Чистые продукты,
медикаменты, диагностикумы.
Гормоны и др. продукты
биотрансформации
Органические кислоты.
Полисахариды.
белок одноклеточных.
Пищевые продукты.
Экстракты, гидролизаты.
Спирты,
органические растворители.
Антибиотики
Аминокислоты.
Ферменты, витамины.
Металлы, неметаллы.
Моноклональные антитела.
биологических микроустройств для использования в аналитике, преобра-
зовании энергии и биоэлектрокатализе.
К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития
биотехнологии относят растительные и животные ткани, в том числе гиб-
ридомы, трансплантанты. Большое внимание в настоящее время уделяется
получению новейших биологических агентов – трансгенных клеток мик-
роорганизмов, растений, животных генноинженерными методами. Разви-
ты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с
использованием различных синтетических и биологических материалов
(мембраны с заданными свойствами, изотопы, магнитные материалы, ан-
титела). Разрабатываются подходы к конструированию ферментов с за-
данными свойствами, имеющими повышенную реакционную активность и
стабильность. В настоящее время реализован синтез полипептидов желае-
мой стереоконфигурации и пр.
Таким образом, в биотехнологических процессах возможно использо-
вание различных биологических агентов с различным уровнем организа-
ции, – от клеточной до молекулярной.
Субстраты и среды, используемые в биотехнологии, весьма разнооб-
разны, и их спектр непрерывно расширяется (табл. 1.2). С развитием про-
мышленных процессов происходит накопление новых видов отходов, ко-
торые могут быть обезврежены и конвертированы в полезные продукты
методами биотехнологии. С одной стороны, развивающиеся бурными тем-
пами биотехнологические промышленные направления сталкиваются с
проблемой исчерпания традиционных видов сырья, поэтому возникает
необходимость в расширении сырьевой базы, с другой, – увеличение объ-
емов накапливающихся отходов делает необходимым разработку нетра-
диционных, в том числе биотехнологических способов их переработки.
В настоящее время наблюдается рост интереса биотехнологов к при-
родным возобновляемым ресурсам – продуктам фотосинтеза, биоресурсам
мирового океана. В состав сред для биотехнологических процессов входят
источники углерода и энергии, а также минеральные элементы и ростовые
факторы. В качестве источников углерода и энергии в биотехнологиче-
ских процессах используют главным образом природные комплексные
среды неопределенного состава (отходы различных производств, продук-
ты переработки растительного сырья, компоненты сточных вод и пр.), в
которых помимо углеродных соединений содержатся также минеральные
элементы и ростовые факторы. Довольно широко включены в разряд био-
технологических субстратов целлюлоза, гидролизаты полисахаридов и
древесины. Последние около 30 лет используют для получения белка од-
ноклеточных. Кислотный гидролиз древесины при 175–190°С обеспечива-
ет выход в среду до 45–50 % редуцирующих веществ; при более жестких
режимах гидролиза эта величина возрастает до 55–68 %. С большим успе-
хом в последние годы стали применять гидролизаты торфа, это позволяет
снизить стоимость, например, препаратов аминокислот в 4–5 раз. Мине-
ральные элементы, необходимые для роста биологических агентов и вхо-
дящие в состав питательных сред, подразделяются на макро- и микроэле-
менты. Среди макроэлементов на первом месте стоит азот, так как по-
требности в нем у биологических объектов на порядок превышают по-
требности в других элементах (фосфоре, сере, калии и магнии). Азот
обычно используется микроорганизмами в восстановленной форме (моче-
вина, аммоний или их соли). Часто азот вводится в комплексе с другими
макроэлементами – фосфором, серой. Для этого в качестве их источников
используют соли (сульфаты или фосфаты аммония). Для ряда отдельных
продуцентов, однако, лучшими являются нитраты или органические со-
единения азота. Существенное значение при обеспечении азотного пита-
ния продуцента имеет не только вид, но концентрация азота в среде, так
как изменение соотношения C:N, воздействуя на скорость роста проду-
цента, метаболизм, вызывает сверхсинтез ряда целевых продуктов (ами-
нокислот, полисахаридов и др.). Минеральные элементы необходимы для
роста любого биологического агента, но их концентрация в среде в зави-
симости от биологии используемого биообъекта и задач биотехнологиче-
ского процесса различна. Так, концентрация макроэлементов в среде (K,
Mg, P, S) обычно составляет около 10–3–10–4 М. Потребности в микроэле-
ментах невелики, и их концентрация в средах существенно ниже – 10–6–
10–8 М. Поэтому микроэлементы часто специально не вносят в среде, так
как их примеси в основных солях и воде обеспечивают потребности про-
дуцентов. Отдельные продуценты в силу специфики метаболизма или пи-
тательных потребностей нуждаются для роста в наличие в среде ростовых
факторов (отдельных аминокислот, витаминов и пр.). Помимо чистых ин-
дивидуальных веществ такой природы, на практике часто используют в
качестве ростовых добавок кукурузный или дрожжевой экстракт, карто-
фельный сок, экстракт проростков ячменя, зерновых отходов и отходов
молочной промышленности. Стимулирующее действие данных ростовых
факторов во многом зависит от индивидуальных свойств применяемого
продуцента, состава основной среды, условий ферментации и др. Добав-
ление ростовых факторов способно увеличить выход целевого продукта,
например ферментов, в десятки раз.
Традиционно состав питательной среды, оптимальной для биотехноло-
гического процесса, определяется методом длительного эмпирического
подбора, в ходе которого на первых этапах определяется качественный и
количественный состав среды. Было сделано много попыток обоснования
состава сред с позиций физиологии и биохимии продуцента, но так как
потребности в питательных веществах видо- и даже штаммоспецифичны,
в каждом конкретном случае приходится подбирать оптимальный для кон-
кретного продуцента состав среды. В последние 20–25 лет все шире ис-
пользуют математический метод планирования экспериментов, математи-
ческое моделирование биотехнологических процессов; это позволяет
обоснованно подходить к конструированию питательных сред сделать их
экономичными.
Аппаратура. Вопросами технического обеспечения биотехнологиче-
ских процессов занимается биоинженерия. Для различных процессов су-
ществует огромное разнообразие аппаратуры: собственно для процесса
ферментации, а также для выделения и получения готового продукта.
Наиболее сложна и специфична аппаратура для ферментационной стадии.
Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэроб-
ный глубинный стерильный и непрерывный (или с подпиткой субстра-
том). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее
сложны и энергоемки. В современной литературе описаны сотни биореак-
торов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от
нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Многочисленность
методов культивирование, чрезвычайное многообразие используемых
биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктив-
ных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и сре-
ды, технологии и масштабов производства, а также целевого продукта и
пр. Техническое оснащение биотехнологии базируется на общих положе-
ниях технической биохимии и пищевой технологии, однако имеет свою
специфику. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от
чисто химических заключается в следующем:
– чувствительность биологических агентов к физико-механическим
воздействиям;
– наличие межфазового переноса веществ (по типу «жидкость – клет-
ки», «газ – жидкость – клетки»);
– требования условий асептики;
– низкие скорости протекания многих процессов в целом;
– нестабильность целевых продуктов;
– пенообразование;
– сложность механизмов регуляции роста и биосинтеза.
Рассмотрим некоторые типы ферментационных аппаратов.
Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяют-
ся в процессах конверсии растительного сырья, в том числе растительных
отходов, а также различных промышленных отходов. При метановом бро-
жении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получе-
ние ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты
(метанотенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой
выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобе-
тонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров)
(рис.1.5). Метановые установки оборудованы системой подачи сырья,
системой теплообменах труб для стабилизации температуры, несложным
перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и
биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного
объема (газгольдер) для сбора образуемого биогаза.
Конструкция аппаратов для аэробной ферментации определяется ти-
пом ферментации и сырья. Аппараты для аэробной поверхностной фер-
ментации, широко применяемые для производства органических кислот и
ферментов, достаточно просты по конструкции и, соответственно, подраз-
деляются на жидкофазные и твердофазные. Поверхностная жидкофазная
ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых
камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кю-
веты. В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя со-
ставляет 80–150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду инокули-
руют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, темпера-
тура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культураль-
ная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцера
и поступает на обработку. При твердофазной ферментации процесс также
протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах раз-
мещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15
мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит
через перфорированное днище лотков.
Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как
конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача,
возникающая при их конструировании, – обеспечение высокой интенсив-
ности массо- и энергообмена клеток со средой. Массообмен определяется
транспортом (переносом) кислорода и других биогенных элементов из
среды в микробную клетку и отводом из нее продуктов обмена. Главным
показателем массообменных характеристик ферментера служит коэффи-
циент массопередачи кислорода, так как кислород является основным ли-
3 4
отходы
биогаз
Рис. 1.5. Схема метановой установки.
1 – дозирующее устройство, 2 – теплообменник, 3 – метанотенк; 4 – газгольдер.
митирующим фактором аэробных ферментационных процессов. Расход
кислорода на образование 1 кг биомассы в зависимости от типа углерод-
содержащего сырья и степени его восстановленности может составлять от
0.75 до 5.00 кг. Клетки способны утилизировать кислород только в рас-
творенном виде, поэтому необходимо постоянно поддерживать его кон-
центрацию в культуре на уровне, оптимальном для конкретного проду-
цента. При этом скорость поступления кислорода к клеткам должна пре-
вышать скорость его включения в клетки, и в околоклеточном простран-
стве не должно возникать так называемых «концентрационных ям». Кро-
ме этого, концентрация клеток и растворенного субстрата должны быть
равномерными по всему объему ферментера. Поэтому перемешивание
является также одним из основных факторов, обеспечивающих требуемую
гидродинамическую обстановку в аппарате. При интенсивном перемеши-
вании пузырьки воздуха дробятся в аппарате и диспергируясь увеличива-
ют площадь контакта фаз «среда-клетка». Однако чрезмерное перемеши-
вание может вызвать механическое повреждение биологических объектов.
К настоящему времени разработано и применяется огромное количест-
во разнообразнейших перемешивающих и аэрирующих устройств, и клас-
сифицировать их практически невозможно. Наиболее удачна, по нашему
мнению, попытка классификации ферментационных аппаратов для аэроб-
ной глубинной ферментации по подводу энергии (Виестур ______и др., 1986;
1987). Согласно этой классификации, аппараты такого типа делятся на три
группы по подводу энергии: 1) – к газовой фазе, 2) – к жидкой фазе, 3) –
комбинированный подвод.
Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе (группа ФГ). Их
общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая
является ее носителем. Ферментеры характеризуются достаточно простой
конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой экс-
плуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные
характеристики (коэффициент массопередачи кислорода менее 4 кг/м3)
(рис. 1.6). Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость,
снабженную газораспределительным устройством одного из известных
типов. Барботажныегазораспределительные устройства обычно устанав-
ливаются в нижней части аппарата. Подаваемый сверху через распредели-
тельную трубу воздух, пройдя через барботер, насыщает кислородом тол-
щу среды. Коэффициент массопереноса кислорода невысок, 1–2 кг/м3 ч;
барботажно-колонный – в нижней части корпуса такого аппарата устанав-
ливается перфорированная пластина с диаметром отверстий 0.0005 м или
сопловой эжектор с диаметром сопла 0.004 м; барботажно-эрлифтный
аппарат характеризуется наличием внутри одного или нескольких диффу-
зо
в) Воздух
а) Воздух
Воздух
б)
Воздух
г)
Воздух
д)
Воздух
е)
Рис. 1.6. Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ) (Виестур и др., 1986).
а) барботажный: 1 – корпус, 2 – воздухораспределитель, 3 – карман, 4 коллектор, б) барботажный колон-
ный: 1 – корпус, 2 – рубашка, 3 – воздухораспределитель, в) барботажно-эрлифтный: 1 – корпус, 2 – диф-
фузор-теплообменник, 3 – воздухораспределитлье; г) газлифтный: 1 – корпус,2 – диффузор, 3 – дисперга-
тор,
4 – воздухораспределитель, 5 – теплообменник, д) трубчатый: 1 – пеногаситель, 2 – емкость, 3 – дисперга-
тор, 4 – корпус, 5 – распределительная перегородка, е) с плавающей насадкой: 1 – рубашка, 2 – тарелка,
3 – насадка, 4 – корпус.
а)
3 1
Воздух
б)
Воздух
в)
г)
Рис. 1.7. Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ЖФ) (Виестур и др. 1986).
а) – с самовсасывающей мешалкой: 1 – корпус, 2 – мешалка, 3 – циркуляционный контур-теплообменник,
б) – эжекционный: 1 – корпус, 2 – насос, 3 – эжектор, в) – струйный с затопленной струей: 1 – эжектор, 2 –
теплообменник, 3 – корпус, 4 – насос, 5 – рассекатель, 6 – труба с насадкой, г) – струйный с плавающей
струей: 1 – теплообменник, 2 – насос, 3 – корпус, 4 – эжектор.
ров («стаканов») или нескольких перегородок для принудительного раз-
деления восходящих и нисходящих потоков циркулирующей жидкости;
эти элементы расположены равномерно по сечению аппарата или концен-
трично; газлифтный колонный ферментер состоит из двух колонн разного
диаметра, соединенных между собой; одна представляет собой барботаж-
ную колонну с восходящим потоком воздуха, другая – циркуляционная, с
нисходящим потоком. Воздух вводится в нижнюю зону аппарата в барбо-
тажную колонну; камера, соединяющая колонны в верхней части аппара-
та, образует большую поверхность контакта фаз; трубчатый аппарат скон-
струирован по типу теплообменных труб; взаимодействие газа в трубе при
высоких скоростях продувки более интенсивное, чем в большом объеме,
поэтому массообмен интенсивнее; аппарат с плавающей насадкой позво-
ляет интенсифицировать массообмен за счет увеличения поверхности кон-
такта фаз и турбулизации жидкости при работе с большими скоростями
подачи газовой и жидкой фаз. В аппарат введены секционные элементы в
виде решеток, оборудованных лопастной насадкой; в центре аппарата на-
ходится труба, через которую вводится воздух, а жидкая фаза поступает
противотоком сверху. Газ, поступая на лопастную насадку, обычно из по-
лиэтилена, вращает ее; это существенно увеличивает поверхность контак-
та газовой и жидкой фаз.
Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ) наибо-
лее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают наиболее вы-
сокие по сравнению с группой ферментеров ГФ значения коэффициента
массопередачи кислорода, свыше 6 кг/м3 ч. В данных аппаратах ввод энер-
гии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалка-
ми или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат че-
рез специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппа-
раты также можно подразделит на ряд типов (рис. 1.7): ферментеры с са-
мовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных
машин, так как поступление в них воздуха происходит в результате раз-
режения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с
жидкостью, отбрасываемой лопатками мешалки; в эжекционных фермен-
терах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, одна-
ко требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержа-
щей культуральной среды. Применение эжекционного ввода газовых суб-
стратов в ферментер может интенсифицировать массообмен на порядок;
струйные ферментеры (с затопленной или падающей струей) оборудуются
мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из ниж-
ней части аппарата и через напорный трубопровод подводят поток к аэри-
рующему устройству (по типу шахтного перепада или напорно-струйные).
Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает
аэрируемую жидкость до дна аппарата. Происходят интенсивные турбу-
лизация и перемешивание жидкости. Внизу жидкость вновь засасывается
насосом и снова подается вверх аппарата, то есть возникает замкнутый
контур циркуляции. Недостатком данных аппаратов являются потери
энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с
отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы
струйных и эжекционных устройств.
Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фа-
зами(группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами яв-
ляются перемешивающие устройства всех известных типов, а также нали-
чие в совокупности насосов и перемешивающих устройств. Это могут
быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для пере-
качивания культуральной жидкости и другие сочетания перемешивающих
и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких
ферментерах может в принципе иметь любые из известных значения.
Перечисленные типы аппаратов возникли в основном в течение «эры»
антибиотиков и белка одноклеточных и применяются, главным образом, в
технической микробиологии.
Прогресс в области получения клеточных и рекомбинантных культур
выдвигает специальные требования к биореакторам. При этом на первый
план выдвигаются такие показатели, как стабильность биологических
агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых усло-
вий при перемешивании и др. Однако, многие из таких конструкций пока
еще носят экспериментальный характер.
Продукты.Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологиче-
ских процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам произ-
водства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, осно-
ванных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразде-
ляются на три основные группы:
1 группа – биомасса, которая является целевым продуктом (белок од-
ноклеточных) или используется в качестве биологического агента (био-
метаногенез, бактериальное выщелачивание металлов);
2 группа – первичные метаболиты – это низкомолекулярные соедине-
ния, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных
блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органиче-
ские кислоты);
3 группа – вторичные метаболиты (идиолиты) – это соединения, не
требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (ан-
тибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).
Среди продуктов микробиологического синтеза – огромное количество
различных биологически активных соединений, в том числе белковых и
лекарственных веществ, ферментов, а также энергоносители (биогаз,
спирты) и минеральные ресурсы (металлы), средства для борьбы с вреди-
телями сельскохозяйственных культур (биоинсектициды) и биоудобрения
(табл. 1.1, 1.2). В связи с развитием новейших методов биотехнологии
(инженерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спектр целе-
вых продуктов непрерывно дополняется. Среди них все большее место
занимают средства диагностики и лечения (гибридомы, моноклональные
антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиоти-
ки).