Причины возникновения новой науки и ее основные подходы

Наука протеомика одна из самых молодых фундаментальных наук (если не самой молодой), которая родилась всего лишь несколько лет назад вместе с теми, кто еще сейчас учится в начальной школе. Можно точно сказать, при каких обстоятельствах она возникла, указать год, когда появилось ее название и кто его придумал.

Во второй половине XX в. бурно развивались аналитические методы биохимии, молекулярной биологии и вычислительной техники. Выдающиеся успехи, достигнутые в этих областях, привели к возможности расшифровки огромных последовательностей оснований нуклеиновых кислот и к записи полного генома живого организма. Впервые полный геном был расшифрован в 1980 г. [1] у бактериофага phi Х-174 (около 5·103 оснований), затем у первой бактерии – Haemophilus influenzae (1, 8·106 оснований) [2]. А c завершением XX в. была закончена грандиозная работа по расшифровке полного генома человека – выявлению последовательности примерно 3 млрд оснований нуклеиновых кислот [3]. На эту работу было затрачено несколько миллиардов долларов (примерно по одному доллару на одно основание). Всего же уже расшифрованы геномы нескольких десятков видов живых организмов. Именно в этот период возникли две новые биологические науки: в 1987 г. впервые в научной печати было использовано слово «геномика» [4], а в 1993 г. – «биоинформатика» [5].

У каждого биологического вида часть генома представлена участками, кодирующими аминокислотные последовательности белков. Например, таких участков у человека насчитывается порядка 100 000 (по некоторым оценкам, это число может достигать 300 000, а с учетом химически модифицированных структур – нескольких миллионов). Казалось бы, зная полный геном и генетический код, можно путем трансляции получить все сведения о структуре белков. Однако все не так просто. Постепенно становилось очевидным, что в данной рассматриваемой клеточной системе организма нет корреляции между наборами мРНК и белков. Кроме того, многие белки, синтезированные на рибосомах в соответствии с нуклеотидной последовательностью, после синтеза подвергаются химическим модификациям и могут существовать в организме в модифицированной и немодифицированной формах. И еще немаловажно то, что белки обладают разнообразными пространственными структурами, которые на сегодняшний день нельзя определить по линейным последовательностям нуклеотидов и даже аминокислот. Поэтому прямое выделение и определение структур всех функционирующих белков остается по-прежнему актуальной задачей (прямое определение структуры на сегодняшний день осуществлено примерно лишь для 10% белков человека). Так, в дополнение к геномике появился термин «протеомика», объектом исследования которой является протеом (от англ. PROTEins – белки и genOMe – геном). А в научной печати упоминание о протеоме впервые появилось в 1995 г. [6].

Следует добавить, что большую роль в жизнедеятельности организмов играют многочисленные короткие фрагменты белковых предшественников, которые называются олигопептидами, или просто пептидами. Именно из-за них наблюдается такой разнобой в оценке количества белково-пептидных компонентов у представителей одного биологического вида. Поэтому наряду с терминами «протеом» и «протеомика» в настоящее время уже употребляются такие термины, как «пептидом» и «пептидомика», представляющие собой часть протеома и протеомики. О многообразии структуры и функций белков и пептидов на страницах газеты «Биология» нами было рассказано ранее [7].

Итак, сформулируем определения новых наук, которые появились при жизни нынешнего молодого поколения и которые тесно взаимосвязаны друг с другом (рис. 1).

Рис.1 http://www.kazedu.kz/images/referats/a65/197347/1.png

Геномика – наука, занимающаяся изучением структуры и функций генов (геном – совокупность всех генов организма).

Биоинформатика – наука, занимающаяся изучением биологической информации с помощью математических, статистических и компьютерных методов.

Протеомика – наука, занимающаяся изучением совокупности белков и их взаимодействий в живых организмах (протеом – совокупность всех белков организма).

Отметим также, что протеомика в общих чертах включает в себя структурную протеомику, функциональную протеомику и прикладную протеомику, которые мы рассмотрим в отдельности.

Структурная протеомика

Наиболее яркой особенностью биологии является разнообразие. Оно просматривается на всех уровнях биологической организации (биологические виды, морфология, химическая структура молекул, сеть регуляторных процессов и т.д.). В полной мере это относится и к белкам. Масштаб их структурного разнообразия до сих пор до конца не выявлен. Достаточно сказать, что число аминокислотных остатков в одном белке может составлять от двух (минимальная структура, имеющая пептидную связь) до десятков тысяч, а белок титин человека содержит 34 350 аминокислотных остатков и на сегодняшний день является рекордсменом – самой крупной из всех известных белковых молекул.

Чтобы получить сведения о протеоме, необходимо сначала его выделить и очистить от других молекул. Поскольку число белков во всем протеоме (т.е. во всем организме) весьма велико, обычно берут только часть организма (его орган или ткань) и различными методами выделяют белковую компоненту. За почти 200-летнюю историю изучения белков разработано множество методов выделения белков – от простого солевого осаждения до современных сложных методов, учитывающих различные физические и химические свойства этих веществ. После получения чистой фракции индивидуального белка определяется его химическая структура.

В структурной протеомике проводится определение структуры не одного, а сразу множества белков, и к настоящему времени для этого разработан специальный цикл процедур и создан арсенал соответствующих высокоточных приборов. (Полный набор оборудования для протеомных исследований стоит более одного миллиона долларов.)

На рис. 2 приведена схема лабораторного цикла от приготовления образца до определения его структуры. После выделения и очистки (на рисунке представлен уже выделенный и очищенный препарат) с помощью двумерного электрофореза проводится разделение белков. Это разделение идет по двум направлениям: в одном разделяются молекулы белка, имеющие разную массу, в другом – различный суммарный электрический заряд. В результате этой тончайшей процедуры на специальном носителе одинаковые молекулы группируются, образуя макроскопические пятна, причем в каждом пятне содержатся только одинаковые молекулы. Число пятен, т.е. число разных белков или пептидов, может составлять многие тысячи (рис. 3, 4), и для их исследования используются автоматические устройства для обработки и анализа. Затем проводится отбор пятен и введение содержащихся в них веществ в сложнейший физический прибор – масс-спектрометр, с помощью которого и определяется химическая (первичная) структура каждого белка.

Первичную структуру белка можно также определить, пользуясь результатами геномики и биоинформатики. На рис. 5 дана полная структура гена сывороточного альбумина человека. Она содержит 1830 азотистых оснований, кодирующих 610 аминокислотных остатков. Этот ген, как и абсолютное большинство других, начинается с кодона atg, кодирующего остаток метионина, и заканчивается одним из стоп-кодонов, в данном случае taa. Таким образом кодируется структура, состоящая из 609 аминокислотных остатков (рис. 6). Однако эта структура – молекула еще не сывороточного альбумина, а лишь его предшественника. Первые 24 аминокислотных остатка представляют собой так называемый сигнальный пептид, который при переходе молекулы из ядра в цитоплазму отщепляется, и только после этого образуется структура сывороточного альбумина, получаемая при выделении этого белка. В итоге данная молекула содержит 385 аминокислотных остатков.

Однако аминокислотная последовательность не раскрывает пространственную структуру белка. С точки зрения термодинамики, вытянутая линейная структура энергетически невыгодна, и поэтому она специфическим для каждой последовательности образом сворачивается в уникальную пространственную структуру, которая может быть определена с помощью двух мощных физических методов – рентгеноструктурного анализа и метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии). С помощью первого из них определены пространственные структуры уже нескольких тысяч белков, в том числе и сывороточного альбумина человека, изображение которого представлено на рис. 7. Эта структура, в отличие от первичной (аминокислотной последовательности), называется третичной и в ней хорошо видны спирализованные участки, являющиеся элементами вторичной структуры.

Таким образом, задача структурной протеомики сводится к выделению, очистке, определению первичной, вторичной и третичной структур всех белков живого организма, а ее основными средствами являются двумерный электрофорез, масс-спектрометрия и биоинформатика.

Биоинформатика белков

Существование огромного количества разнообразных белков привело к необходимости создания информационных массивов – баз (или банков) данных, в которые заносились бы все известные о них сведения. В настоящее время существует множество общих и специализированных баз данных, которые доступны в Интернете каждому желающему. В общих базах содержатся сведения о всех известных белках живых организмов, т.е. о глобальном протеоме всего живого. Примером такой базы является SwissProt-TrEMBL (Швейцария–Германия), в которой на сегодняшний день содержатся структуры почти 200 000 белков, установленные аналитическими методами, и еще почти 2 млн структур, которые определены в результате трансляции с нуклеотидных последовательностей [10]. На рис. 8 и 9 показано количество существующих белков, которые известны для каждого заданного числа аминокислотных остатков. Оси абсцисс на этих графиках ограничены 2000 остатков, но, как уже сказано выше, хотя и не часто, но встречаются и существенно более крупные молекулы. Из данных, представленных на рисунках, следует, что наибольшее число белков содержит по несколько сотен аминокислотных остатков. К ним относятся ферменты и другие достаточно мобильные молекулы. Среди более крупных белков много таких, которые выполняют опорную или защитную функции, скрепляя биологические структуры и придавая им прочность.

В глобальном протеоме особое место занимают небольшие очень подвижные молекулы, содержащие не более 50 аминокислотных остатков и обладающие специфическим спектром функциональной активности. Они называются олигопептидами, или просто пептидами. Для них, т.е. для глобального пептидома, создан особый банк данных, который называется EROP-Moscow. Это название представляет собой аббревиатуру от термина Endogenous Regulatory OligoPeptides (эндогенные регуляторные олигопептиды), и указывает на то, что банк создан и базируется в столице нашей страны [11]. На сегодняшний день расшифрована структура почти 6000 олигопептидов, выделенных из представителей всех царств живого. Так же как и крупные белки, количество олигопептидов с заданным числом аминокислотных остатков можно изобразить графически (рис. 10). Судя по графику, чаще всего встречаются олигопептиды, содержащие примерно 8–10 аминокислотных остатков. Среди них в основном содержатся молекулы, которые участвуют в регуляции нервной системы, и поэтому называются нейропептидами. Очевидно, что самые быстрые процессы в живом организме осуществляются с участием нервной системы, поэтому пептидные регуляторы должны быть мобильными и следовательно небольшими. Однако, следует отметить, что, ввиду огромного структурного и функционального разнообразия как белков, так и пептидов, для них до сих пор не создано строгой классификации.

Таким образом, в данном случае задачами биоинформатики являются накопление информации о физико-химических и биологических свойствах белков, анализ этой информации, каталогизация и подготовка информационной базы и вычислительных средств для выявления механизмов их функционирования.

Функциональная протеомика

Наличие в организме того или иного белка дает основание предполагать, что он обладает (или обладал) определенной функцией, а весь протеом служит для того, чтобы осуществлялась полноценная жизнедеятельность всего организма. Функциональная протеомика занимается определением функциональных свойств протеома, и решаемые ею задачи существенно сложнее, чем, например, определение белково-пептидных структур.

Очевидно, что функционирование протеома осуществляется в многокомпонентной среде, в которой присутствует множество молекул других химических классов – сахаров, липидов, простагландинов, различных ионов и многих других, включая молекулы воды. Не исключено, что через некоторое время появятся такие термины, как «сахаром», «липидом» и им подобные. Белковые молекулы взаимодействуют с окружающими их другими или такими же, как и они, структурами, что в конечном итоге приводит к возникновению функциональных реакций сначала на молекулярном уровне, а затем и на макроскопическом. Уже известно множество таких процессов, в том числе с участием белков. Среди них взаимодействие фермента с субстратом, антигена с антителом, пептидов с рецепторами, токсинов с ионными каналами и т.д. (рецепторы и ионные каналы также являются белковыми образованиями). Для выявления механизмов этих процессов проводятся как экспериментальные исследования индивидуальных участников взаимодействия, так и системные исследования средствами биоинформатики. Рассмотрим несколько примеров таких системных подходов.

На рис. 11 показаны представители протеома (в данном случае пептидома) человека – различные гастрины и холецистокинины, которые локализованы в желудочно-кишечном тракте (при написании аминокислотных последовательностей использован стандартный однобуквенный код, расшифровка которого была дана нами ранее [7]). Функциональными частями молекул этих пептидов являются очень схожие правые области. Однако пептиды обладают прямо противоположными поведенческими свойствами: гастрины вызывают у человека ощущение голода, а холецистокинины – сытости. По-видимому, данное различие обусловлено тем, что в первичной последовательности холецистокининов положение остатка тирозина Y сдвинуто на один шаг по сравнению с гастринами. На том же рисунке приведена первичная структура пептида ционина, полученного из представителя простейших хордовых Ciona intestinalis (рис. 12). Его структура гомологична и гастринам, и холецистокининам и характеризуется двумя остатками тирозина, находящимися в тех же положениях, что и у обоих указанных пептидов. К сожалению, функциональные свойства его не изучены. А при должном экспериментальном исследовании можно было бы ответить на вопрос, какова роль химической структуры в целом и остатков тирозина в частности при проявлении противоположных физиологических эффектов.

Другой пример: на рис. 13 приведены аминокислотные последовательности очень похожих молекул, которые также объединены в структурно-гомологичное семейство. Эти молекулы обнаружены у весьма эволюционно далеких живых организмов – от насекомых до млекопитающих. В первой строке дана первичная структура брадикинина, содержащего 9 аминокислотных остатков и встречающегося у многих высших организмов, в том числе и у человека. В течение многих лет химики синтезировали различные неприродные аналоги этой молекулы, чтобы ответить на вопрос, какой ее участок ответственен за взаимодействие с рецептором. Около 30 лет назад были даже синтезированы все возможные фрагменты брадикинина – 8 дипептидов, 7 трипептидов и т.д. (всего возможны 36 фрагментов), величину активности которых затем испытывали в одном и том же биологическом тесте. Результат оказался тривиальным: выяснилось, что максимальную активность проявляет лишь вся молекула целиком, а каждый фрагмент по отдельности обладает либо следовой активностью, либо нулевой. Эту трудоемкую работу не пришлось бы делать, если бы в то время были известны другие брадикинины, приведенные на рис. 13, и средствами биоинформатики они были бы выделены из глобального протеома. Представленное структурно-гомологичное семейство наглядно демонстрирует, что у всех молекул есть область, которая в результате биологической эволюции практически не изменялась (квазиконсервативная область), и она представляет собой молекулу брадикинина высших живых организмов, отобранную как наиболее совершенную в результате эволюционного процесса. Данный пример демонстрирует, что протеомика вместе с биоинформатикой позволяет быстро (и дешево) решать принципиальные научные проблемы.

И, наконец, третий пример – структурно-гомологичное семейство эндотелинов млекопитающих и токсинов змей (рис. 14). Несмотря на поразительное сходство структур, их функциональные свойства разительно отличаются друг от друга: одни являются очень полезными регуляторами сосудистого сокращения, а другие – смертельно опасны для жизни. В данном случае мы сталкиваемся с ситуацией, когда первичная структура не несет достаточной информации, способной объяснить причину различия функций, и необходимо более детальное рассмотрение пространственной (третичной) структуры. На рис. 15 и 16 показаны пространственные структуры двух представителей этого семейства – эндотелина-1 и сарафотоксина 6b, полученные с помощью ЯМР-спектроскопии. На рисунках они повернуты так, чтобы достичь максимальной пространственной гомологии. Но полной гомологии не удается получить ни при каком повороте. Следовательно, несмотря на большое сходство первичных структур, взаимодействие их осуществляется с разными рецепторными структурами, а потому и приводит к разным физиологическим эффектам.

Конечно столь частными примерами невозможно полностью охарактеризовать многообразие функциональной протеомики. Создание представлений об огромной сети взаимодействий белковых и других молекул в организме требует огромного труда и применения всех средств современной биоинформатики. По существу, создание таких представлений еще только начинается. Однако есть основание полагать, что с каждым годом наши познания в этой области будут быстро расти.

Одним из первых успехов на этом пути является создание карты метаболизма карбоновых кислот в Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (рис. 17). Эта карта представляет собой сеть реакций с регулярным периодическим строением. Такой подход оказался успешным ввиду того, что функционально аналогичные метаболиты претерпевают сходные биохимические превращения, образуя функционально аналогичные производные. В карте по вертикали расположены области, содержащие соединения с одинаковым числом атомов углерода (от 1 до 10), а горизонтальные ряды представляют собой ряды функционально аналогичных метаболитов. Химические структуры на карте соединены многочисленными стрелками с указанием, какие ферменты (белки) участвуют в соответствующих химических превращениях. Не правда ли, такой подход напоминает периодическую систему химических элементов Д.И. Менделеева? И так же, как и менделеевская система, данная карта обладает прогностической силой. С ее помощью был предсказан целый ряд новых ферментов, которые впоследствии были обнаружены экспериментально.

Подобные схемы могут быть распространены и на другие метаболические процессы (например, углеводов, аминокислот и т.д.), а также использованы для поиска новых метаболитов биохимических реакций.

Таким образом, функциональная протеомика занимается изучением сложных взаимосвязей структуры и функций протеома.

Практическая протеомика

Итак, главной задачей протеомики является выявление механизма взаимодействия огромного числа белков и пептидов в одном организме. Какова же практическая значимость этой грандиозной и дорогостоящей работы? Очевидно, что в первую очередь в результатах такой работы заинтересованы фармакологи и медики, поскольку очень часто прослеживается тесная связь между изменениями в белковом составе и болезненным состоянием человека. Поэтому новые данные в протеомике будут использоваться (и уже используются) для быстрой разработки новых лекарственных средств и новейших методов лечения болезней, с которыми медицина боролась веками. На сегодняшний день 95% всех фармакологических средств воздействуют на белки. Протеомика со своим системным подходом может помочь идентифицировать и оценить важность появления новых белков гораздо эффективнее, что, в свою очередь, ускорит разработку новых диагностических тестов и терапевтических средств.

Первое практическое применение протеомных исследований состоялось задолго до появления термина «протеомика», еще в начале XX в., когда была обнаружена роль инсулина в развитии такого тяжелого заболевания, как диабет. Создание инсулиновых препаратов спасло жизнь миллионам людей.

В настоящее же время протеомика, вместе с геномикой и биоинформатикой, ориентирована на создание новых лекарственных препаратов (рис. 18), в которых молекулярными мишенями будут служить те или иные белки [13]. Процесс нахождения новых мишеней для действия лекарств решается с помощью биоинформатики, причем объектом анализа является геном. Однако после анализа генома необходимо получить доказательства того, что данный белок интенсивно экспрессируется и находится в клетке в рабочем состоянии. Эту задачу решает протеомика. Таким образом выявляется молекулярная генетическая мишень для лекарства.

Следует отметить, что протеомика может и сама по себе решать проблему нахождения мишени. Если получить протеомные карты (подобные тем, что представлены на рис. 3 или 4) нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики. Можно предположить, что в будущем к обычному анализу крови добавится создание протеомных карт крови. Для этого в поликлиниках необходимо будет использовать специальное оборудование, с помощью которого у пациентов периодически будут брать кровь. При возникновении болезненного состояния протеомную карту больного человека нужно будет всего лишь сравнить с его же протеомной картой, но составленной в то время, когда он был здоров, и можно будет выявить произошедшие изменения в белковом составе крови и определить причину заболевания. Подобное сравнение протеомов опухолевых и нормальных клеток, клеток до и после воздействия определенных факторов (например, физических или химических), использование биологических жидкостей в диагностических целях – все это представляет огромный интерес и открывает совершенно новые перспективы для медицины, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности и других прикладных областей. Впереди предстоит огромная и интересная работа.

Библиография

1.Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. et al. Nucliotide sequence of bacteriophage phi X-174 DNA.//Nature. 1977. V. 265, № 5596. P. 687–695.

2.Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, № 5223. P. 496–512.

3.Nature. 2001. 409, № 6822 (большая часть выпуска журнала посвящена расшифровке генома человека).

4.Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. The genomics of human homeobox-containing loci.//Pathol. Immunopathol. Res. 1988. V. 7, № 1–2. P. 119–126.

5.Franklin J. Bioinformatics changing the face of information.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. P. 145–152.

6.Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.//Electrophoresis. 1995. V. 16, № 7. P. 1090–1094.

7.Замятнин А.А. Блистающий мир белков и пептидов.//Биология. 2002. № 25–26. P. 8–13.

8.Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.//Proteomics. 2004. V. 4, № 12. P. 3665–3685.

9.Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry.//FEBS Lett. 2004. V. 567, № 1. P. 92–95.

10. http://au.expasy.org/sprot/

11 http://erop.inbi.ras.ru/

12. Малыгин А.Г. Метаболизм карбоновых кислот (периодическая схема). – М.: «Международная программа образования», 1999.

13. Арчаков А.И. Что за геномикой? – Протеомика.//Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 4. С. 335–343.

14. ru.wikipedia.org/wiki/Протеомика

15. www.biomed.spbu.ru/equipment/proteomics/

16. thesaurus.rusnano.com/wiki/article1579

17. www.inbi.ras.ru/ubkh/49/Terentiev.pdf

18. www.strf.ru/material.aspx?CatalogId=352&d_no=11979

19. www.textronica.com/lcline/proteomics/proteomics.html

20. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

21. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

ЛЕКЦИЯ 4.