Определение бактериальной обсемененности молока (ГОСТ 9225 – 84)

Редуктазная проба.Экспериментально установлена зависимость между продолжительностью обесцвечивания метиленовой сини (или резазурина) и приблизительным содержанием микроорганизмов в молоке, по­этому редуктазная проба - косвенный показатель бактериальной обсемененности молока. Микроорганизмы (в т.ч. молочнокислые бактерии), развиваясь в молоке, вырабатывают фермент редуктазу, которая восстанавливает (обесцвечивает) метиленовую синь или резазурин. Чем больше в молоке микроорганизмов, способных вы­делять редуктазу, тем быстрее произойдет обесцвечивание и проба приобретет белый цвет.

1) с метиленовой синью.

Техника определения. В стерильную пробирку наливают 1 мл рабочего раствора метиленовой сини и 20 мл молока. Закрыв про-J бирку стерильной пробкой, молоко смешивают с раствором мети­леновой сини путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Пробирки ставят в редуктазник или водяную баню при температуре 37±1°С, которая остается постоянной на время прове­дения анализа. Вместо водяной бани пробирки можно поставить в термостат, предварительно нагретый до 37°С.

Момент смешивания молока с метиленовой синью фиксируют как начало анализа. За окраской молока наблюдают через 40 мин, 2,5 ч и 3,5 ч. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания метиле­новой сини, при этом не учитывают остающийся вверху неболь­шой (до 1 см) кольцеобразный окрашенный слой или небольшую окрашенную часть внизу пробирки. В зависимости от продолжительности обесцвечивания метиленовой сини молоко относят к одному из четырех классов

Время обесцвечивания	Количество бактерий в 1 мл	Класс молока
стандартный метод	ускоренный метод
свыше 3,5 ч	более 3 ч	до 100 тыс.	высший
от 2,5 до 3,5 ч	от 1 до 3 ч	от 300 тыс. до 500 тыс.	I
от 40 мин до 2,5 ч	от 8 мин до 1 ч	от 500 тыс. до 4 млн.	II
40 мин и менее	менее 8 мин	от 4 млн. до 20 млн.	III

2) с резазурином. Исследование следует проводить не ранее чем через 2 часа после доения. Определение бактериальной обсемененности молока с метиленовой синью требует сравнительно много времени. Одним из методов ускорения анализа является замена метиленовой сини резазурином. В свежем молоке резазурин дает сине-стальное окрашивание. При восстановлении краски ферментом редуктазой цвет меняется от фиолетового до розового, а в дальнейшем окрашивание исчезает:

- О +2Н

С₁₂ Н₇ О₄ ð С₁₂ Н₇ О₃ ó С₁₂ ­Н₉ О₃

резазурин резаруфин дегидрорезаруфин

(сине-стальной) (розовый) (белый)

По сравнению с метиленовой синью (в зависимости от количества микрофлоры) на определение бактериальной обсемененности с резазурином требуется времени до 1 ч, а плохое и очень плохое молоко можно определить по изменению цвета уже через 10 минут.

Техника определения. В стерильные пробирки наливают 10 мл молока и 1 мл рабочего раствора резазурина, закрывают стерильными пробками и медленно перевертывают 3 раза, не допуская встряхивания. Пробирки помещают в редуктазник (водяную баню, термостат) при температуре 37-38 ^о С и отмечают время начала анализа. Изменение окраски отмечают через 1 ч., пробирки, имеющие серо-сиреневую окраску до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. класс молока определя­ют, пользуясь таблицей.

Время обес­цвечивания, ч	Окраска молока	Количество бактерий в 1 мл молока	Класс молока
1,5	серо-сиреневая до сиреневой со слабым серым оттенком	до 100 тыс.	высший
1,0	серо-сиреневая до сиреневой со слабым серым оттенком	от 300 тыс. до 500 тыс.	I
1,0	сиреневая с розовым оттен­ком или ярко-розовая	от 500 тыс. до 4 млн.	II
1,0	бледно-розовая или белая	от 4 млн. до 20 млн.	III

Бродильная проба.Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. В зависимости от времени свертывания и характера образовавшегося сгустка оценивают состав микрофлоры молока и пригодности его для производства сыра. Проба применяется при определении пригодности молока для про­изводства сыра.

Техника определения. В чисто вымытые широкие пробирки, хорошо просушенные и ополоснутые два-три раза тем же молоком, из которо­го отбирают пробу, наливают около 20 см³ молока. Пробирки закрыва­ют ватными пробками и ставят в термостат при температуре 38±1 ^ОС на 24 ч.

Через 12 ч после помещения пробирок в тер­мостат или водяную баню производят первичный осмотр проб. Если молоко не свернулось или лишь начинает свертываться, оно считается хорошим. Если свернулось и сгусток вспученный - плохое. Вторично пробы просматривают спустя еще 12 ч и на основании этого просмотра относят молоко к одному из четырех классов.

Класс	Оценка качества молока	Характеристика сгустка
I	Хорошее	Начало свертывания без выделения сыворотки и пузырьков газа; незначительные полоски на сгустке
II	Удовлетворительное	Сгусток с полосками и пустотами, заполненными сывороткой; сгусток стягивается со слабым выделением сыворотки, структура сгустка мелкозернистая
III	Плохое	Сгусток с обильным выделением зеленоватой или беловатой сыворотки; сгусток крупнозернистый; наблюдают пузырьки газа в сгустке или сливочном слое
IV	Очень плохое	Сгусток разорван и пронизан пузырьками газа; вспучен, как губка

Сычужно бродильная проба. Метод основан на способности некоторых микроор­ганизмов и сычужного фермента свертывать молоко. По характеру об­разовавшегося сгустка оценивают качество молока на его пригодность для производства сыра. Для постановки сычужно-бродильной пробы используют сычужный порошок из сычугов телят и ягнят-молочников, соответствующий по показателям качества следующим данным:

Техника определения. В чисто вымытые широкие пробирки, хорошо просушенные и ополоснутые два-три раза тем молоком, из которого отбирают пробу, наливают около 30 см³ молока, затем вносят в каждую пробирку по 1см³ раствора сычужного фермента, хорошо перемеши­вают и ставят на 12 ч в водяную баню или термостат при температуре 38±1 ^ОС. По истечении 12 ч пробы осматривают и от­носят молоко к одному из трех классов.

Класс	Оценка качества молока	Характеристика сгустка
I	Хорошее	Сгусток с гладкой поверхностью, упругий на ощупь, без глазков на продольном разрезе, плавает в прозрачной сыворотке, которая не тянется и не горькая на вкус
II	Удовлетворительное	Сгусток мягкий на ощупь, с единичными глазками (1 - 10), разорван, но не вспучен
III	Плохое	Сгусток с многочисленными глазками, губчатый, мягкий на ошуль, вспученный, всплыл кверху или вместо сгустка образуется хлопьевидная масса