Определение количества жизнеспособных клеток
Бифидобактерий
Методика определения количества жизнеспособных клеток бифидобактерий основана на способности этих бактерий расти на питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках при температуре (38±1) ºС и образовывать в них через 24–72 ч колонии с типичными для бифидобактерий морфологическими характеристиками. Питательной средой для бифидобактерий может служить плотная среда Блаурокка (или кукурузно-лактозная).
Подготовка проб к анализу
Перед вскрытием поверхность упаковки продукта обмывается, протирается, чтобы удалить грязь, которая может загрязнить продукт. Затем поверхность упаковки протирается 70 %-м этиловым спиртом. Вскрытие упаковки проводится в асептических условиях.
Из каждой упаковки после тщательного перемешивания пипеткой отбирается 10 мл кисломолочного продукта, помещается в стерильную посуду и затем нейтрализуется. Для этого на 10 мл исследуемого продукта в стерильную посуду добавляется 1 мл стерильного раствора натрия гидрокарбоната с массовой концентрацией 100 г/л; содержимое перемешивается с использованием стерильных приспособлений.
К нейтрализованному образцу продукта добавляется физиологический раствор до достижения общего объема пробы 100 мл, после чего смесь опять тщательно перемешивают. Таким образом получают первое разведение продукта (1·10-1). Пипетку промывают до 10 раз полученной смесью до верхнего уровня имеющихся на ней делений.
Последующие десятикратные разведения продукта готовят, добавляя в 9 мл физиологического раствора по 1 мл предыдущего разведения продукта. При этом смесь каждый раз тщательно перемешивают. Таким образом, в седьмой пробирке продукт будет разведен в 108 раз. Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку.
Проведение исследований
Готовят два ряда питательных сред, каждый по пять пробирок, содержащих среду Блаурокка или другую питательную среду в количестве 10 мл для высева в них соответствующих разведений исследуемого продукта.
Перед употреблением среду следует разогреть на кипящей водяной бане в течение 15 мин для снижения в ней содержания растворенного кислорода. При использовании плотных питательных сред перед проведением анализа их следует разогреть в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. В момент использования температура питательных сред должна составлять (38±1) °С.
Внесение посевного материала в среду осуществляют, начиная с последнего разведения, внося в последнюю пробирку каждого из двух рядов среды по 1 мл разведения продукта 1·10-8, затем таким же образом вносят по 1 мл разведения продукта 1·10-7, 1·10-6, 1·10-5, 1·10-4. Так, первая пробирка каждого ряда будет содержать разведение продукта 1·10-4, а последняя 1·10-8. При внесении разведения продукта в среду производят тщательное энергичное перемешивание круговыми движениями руки. Для каждого посева берут новую стерильную пипетку.
Пробирки с посевами образцов продукта выдерживают в термостате с температурой (37±1) °С в течение (72±1) ч, просматривая посевы через 24−48 ч.
Окончательный учет проводят через 72 ч. С целью получения практического опыта учета бифидобактерий в посевах на кафедре за трое суток до проведения занятия делают посевы тех же образцов продуктов.
По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли колонии, типичные для бифидобактерий − в виде «гвоздиков», «вытянутых веретен», иногда в виде «полос», расположенных вдоль пробирки (в плотных средах − в виде крупных «дисков» или «гречишного зерна»), и записывают разведение пробирки. Выросшие колонии подсчитывают.
Подтверждение наличия бифидобактерий осуществляют методом микроскопирования. Для этого из 1·10-8, 1·10-7, 1·10-6, 1·10-5 разведений продукта в питательной среде после инкубации готовят микроскопические препараты, окрашенные метиленовым голубым.
Перед приготовлением микроскопических препаратов пробирки с микробиальным ростом тщательно перемешивают пипеткой до получения однородной смеси. При приготовлении препарата на чистое предметное стекло наносят петлей материал из колонии или небольшую каплю предварительно суспендированного исследуемого материала и распределяют его по площади около 1 см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым.
Бифидобактерии в мазках имеют вид тонких, мелкозернистых, слегка изогнутых палочек с бифуркацией на концах или без нее; располагаются группами в виде римских пятерок, скоплений в виде китайских иероглифов, коротких цепочек.
Поскольку исследуемые продукты являются кисломолочными, в мазках в зависимости от вида продукта присутствуют заквасочные микроорганизмы (мезофильные лактококки, термофильные молочнокислые стрептококки и палочки), а также могут присутствовать клетки дрожжей.
Содержание бифидобактерий в анализируемом продукте определяется по наличию в исследуемом разведении продукта методом микроскопирования.
Вычисление содержания жизнеспособных бифидобактерий в 1 см3 продукта проводят по формуле
Х = а ∙ 10n,
где X − количество жизнеспособных бифидобактерий в 1 см3 продукта; а − среднее количество колоний в последнем, засеянном в двух рядах разведении продукта; n − показатель последнего разведения продукта, в котором отмечен рост бифидобактерий.
При обнаружении бифидобактерий микроскопией мазков придонного материала из того разведения, в котором не отмечено видимого роста колоний, учитывают степень этого разведения.