Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения

Исследование структурно-механических свойств пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Основные понятия реологии: деформация, вязкость, упругость, прочность. Кривые кинетики деформации. Вискозиметрия. Способы определения вязкости пищевых объектов. Примеры определений. Виды вискозиметров и принципы их работы.

Хроматография. Хроматографические методы анализа. Теоретические основы. Экстракция. Классификация хроматографических методов. Параметры удерживания. Основное уравнение хроматографии. Критерий разделения. Фактор разделения. Газовая хроматография. Качественные и количественные определения аминокислотного состава мясных продуктов. Высокоэффективная газожидкостная хроматография (ВЭГЖХ). Тонкослойная хроматография. Препаративная хроматография в тонком слое как экспресс-метод оценки безопасности сырья и мясных продуктов. Определение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии. Примеры применения для установления углеводного и аминокислотного состава мяса.

При оценке качества пищевых продуктов большое значение уделяется их консистенции. Наряду с условными, субъективными методами оценки консистенции все чаще применяются структурно-механические, или реологические, методы.

Реология – сравнительно молодая наука, сформировавшаяся как самостоятельная часть физико-химической механики. Она изучает течение и деформации различных веществ и материалов, широко используя при этом многие положения механики и теории упругости.

Все реальные тела способны деформироваться под воздействием внешних сил, т. е. изменять свою форму и размеры.

Под деформацией понимают относительное смещение частиц тела, при котором не нарушается его непрерывность.Деформация называется упругой, если она исчезает после снятия нагрузки, и остаточной, если после снятия нагрузки она сохраняется. Величина и характер деформации обусловлены свойствами материала тела, его формой и способом приложения внешних сил.

При деформировании тела возникают внутренние силы взаимодействия его отдельных частичек. Меру интенсивности этих внутренних сил называют напряжением.

После прекращения воздействия на тело внешних сил напряжения частично или полностью рассасываются вследствие теплового движения молекул и других элементов.Процесс убывания напряжений во времени называется релаксацией. Время релаксации – важная структурно-механическая характеристика тела.

К реологическим свойствам тела относятся вязкость, упругость, эластичность и прочность.

Вязкость (или внутреннее трение) – свойство газов, жидкостей и твердых тел, обусловливающее сопротивление относительному перемещению слоев (течению под действием внешних сил). Для твердых тел – это сопротивление развитию остаточных деформаций.

Упругость – способность тел сопротивляться изменению их объема и формы под действием внешних сил, т. е. способность тела восстанавливать свою форму после снятия нагрузки.

Эластичность – способность материала при незначительных усилиях испытывать более или менее значительные упругие обратимые деформации без разрушения его структуры. Различие эластичности и упругости состоит в том, что упругость проявляется мгновенно, а эластичность – во времени.

Прочность – способность тела сопротивляться разрушению.

Наряду с указанными терминами используют также понятия: пластичность – свойство тел необратимо деформироваться под воздействием нагрузки и ползучесть – частный случай пластической деформации под действием постоянной нагрузки.Псевдопластичность— свойство, при котором вязкость жидкости уменьшается при увеличении напряжений сдвига.

Многие пищевые массы, помимо твердого и жидкого состояний, образуют структуры, которые по физическим свойствам занимают промежуточное положение. К ним относятся белковыеиуглеводные студни, суспензии разной концентрации (вплоть до паст), эмульсии и пены.

Наличие внутренней структуры придает таким системам определенные механические свойства – упругость, пластичность, вязкость, прочность, которые объективно характеризуют ихконсистенцию. Механические свойства зависят от природы входящих веществ и их соотношения, а также от сил взаимодействия между ними.

При изучении структурно-механических свойств пищевых материалов исследуется развитие деформаций во времени. В основном изучают два вида деформации – сжатие (растяжение) и сдвиг. В первом случае напряжение действует перпендикулярно поверхности образца, во втором – по касательной (тангенциально).

Результаты исследования структурно-механических свойств обычно выражают графически в виде кривых кинетики деформации.

Хроматография

Хроматография – важнейший аналитический метод. Хроматографическими методами можно определять газообразные, жидкие, и твердые вещества с молекулярной массой от единиц до 106. Это могут быть неорганические вещества, например, ионы металлов, изотопы водорода, и органические – белки, синтетические полимеры и т.д. С помощью хроматографии получена обширная информация о строении и свойствах органических соединений многих классов. Хроматографию с успехом применяют в исследовательских и клинических целях в различных областях биохимии и медицины, в фармацевтике, криминалистике, пищевой промышленности, для мониторинга окружающей среды. Универсальность, экспрессность, чувствительность метода обуславливают частое использование хроматографии в аналитических целях.

Возникновение хроматографии как научного метода связано с именем русского ученого-ботаника М.С.Цвета, который впервые применил явление адсорбции для анализа зеленой части хлорофилловых пигментов листьев. В 1903 г. М.С.Цветопубликовал статью, в которой сформулировал принцип нового метода и наглядно показал возможность отделения зеленой части хлорофилловых пигментов от желтой и оранжевой с помощью углекислого кальция (адсорбента). Однако метод хроматографии не использовался вплоть до 1930 года, когда немецкие биохимики Кун, Ледерер, Винтерштейн повторили опыты Цвета и успешно разделили каротин на отдельные изомеры, предсказанные Цветом. С этого времени хроматография стала развиваться в самых разнообразных направлениях.

Сущность хроматографии

Хроматография – это физико-химический метод разделения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами– подвижной и неподвижной. Неподвижной фазой обычно служит твердое вещество (сорбент) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой пере-мещаются вдоль стационарной фазы, которую обычно помещают в ко-лонку (стеклянную или металлическую трубку). Если молекулы разных компонентов разделяемой смеси обладают различной адсорбируемо-стью или растворимостью, то время их пребывания в неподвижной фазе, следовательно, и средняя скорость передвижения по колонке различны. Одни компоненты остаются в верхнем слое сорбента, другие, с меньшей адсорбируемостью, оказываются в нижней части колонки, некоторые покидают колонку вместе с подвижной фазой. Так достигается разделение компонентов.

С помощью хроматографии возможны: разделение сложных смесей органических и неорганических веществ на отдельные компоненты, очистка веществ от примесей, концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов, качественный и количественный анализ исследуемых веществ.

Плоскостная хроматография

К плоскостным видам хроматографии относят бумажную (БХ) и тонкослойную (ТСХ). Эти два вида жидкостной хроматографии просты по технике выполнения, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования. Разделение этими методами может быть выполнено с использованием хроматографических систем жидкость–твердый сорбент и жидкость–жидкость–твердый сорбент, поэтому выделяют адсорбционную,распределительную, обращенно-фазовую и ионообменную плоскостную хроматографию. Тонкослойную хроматографию используют чаще, чем бумажную.

Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии был разработан Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер еще в 1938 г. В методе ТСХ неподвижная твердая фаза (силикагель, оксид алюминия, порошок целлюлозы) тон-ким слоем наносится на стеклянную, пластмассовую или металлическую пластинку. В качестве подвижной фазы используют различные растворители или их смеси, органические и неорганические кислоты. Выбор растворителя зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, при хроматографировании аминокислот используют смесь n-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН. В ТСХ чаще используют восходящий способ полученияхроматограммы. Раствор образца наносят микропипеткой на небольшом расстоянии от края пластинки на стартовую линию, и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действиемкапиллярных сил растворитель поднимается вверх по пластинке и с разной скоростью переносит за собой компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. Чтобы растворитель не испарялся с поверхности сорбента, пластинка на время разделения должна быть помещена в герметически закрытую прозрачную камеру. Разделяемые компоненты на пластинке образуют отдельные зоны (пятна). Хроматографированиепродолжаютдо тех пор, пока растворитель не пройдет от линии старта около 10 см до так называемой линии фронта. После этого пластинку вынимают из хроматографической камеры, подсушивают на воздухе и определяют положение пятен.

Схема разделения смеси веществ методом тонкослойной хроматографии приведена на рис.1.4. Пятна характеризуют положение компонентов А, В, С на пластинке в конце опыта.

Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения - student2.ru

линия фронта

линия старта

Смесь А В С

Рис.1.4. Схема разделения методом восходящей тонкослойной хроматографии

Сорбционные свойства системы в ТСХ характеризуются подвиж-ностьюRf – относительной скоростью перемещения компонентов в тон-ком слое. Величины Rf рассчитываются из экспериментальных данных (рис.1.4.):

R_f=^lⁱ	L	(1.1),

Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения - student2.ru

где li – расстояние от стартовой линии до центра пятна, L – расстояние, пройденное растворителем от стартовой линии до границы фронта растворителя.

Rfхарактеризует положение пятна на хроматограмме. Это констан-та для данного вещества на данном сорбенте в данной системе растворителей. На величину Rfвлияют качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество и природа растворителя, техника эксперимента (способ нанесения пробы, способ детектирования) и другие факторы.

Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения - student2.ru Качественный анализ.Проще всего идентификация вещества может быть сделана, если пятно определяемого вещества имеет характерную окраску. Невидимыехроматограммы проявляют соответствующими реагентами, как правило, групповыми. По характерной окраске образующихся цветных зон судят о составе анализируемой пробы. При обработке пластинки, например, парами иода четко проявляются непредельные соединения; при опрыскивании пластинки тиоцианатом кобальта амины образуют голубые пятна на розово-белом фоне. В физических методах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием УФ-излучения.

Наиболее общий подход к качественному анализу основан на зна-ченияхRf . При соблюдении стандартных условий получаются вос-производимые значения Rf , которые можно использовать в аналитиче-ских целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта; более надежно использовать значения Rf,относительные.

Самым надежным способом является метод свидетелей (стандартных веществ). Стандартное вещество в том же растворителе наносится

на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях (рис.1.4).

Таблица 1.1

Подвижные фазы, проявители, величины Rf некоторых катионов при разделении на микрокристаллической целлюлозе методом ТСХ

Катион	Подвижная фаза, %	Проявитель	Rf
Hg(I)	н-бутанол–вода (85:15);	Водный раствор К2CrO4	0,13
Ag(I)	рН 3,0 (СН3СООН)		0,11
Pb(II)			0,05
Zn(II)	Этанол–5 М HCl(90:10)	Дитизон	0,93
Fe(III)		Самоидентификация	0,80
Co(II)		1-Нитрозо-2-нафтол	0,33
Ni(II)		Диметилглиоксим	0,33
Ca(II)	Изопропанол–вода– 1 М HCl	Ализарин	0,73
Sr(II)	(40:20:20)	Родизонат калия	0,66
Ba(II)		Родизонат калия	0,55

Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения - student2.ru

По окончании хроматографирования и проявления хроматограммы приступают к идентификации веществ. Совпадение Rfкомпонента пробы и одного из свидетелей дает основание для отождествления веществ.

Количественныеопределения в ТСХ могут быть сделаны непосредственно на пластинке, в этом случае каким-либо способом измеряют площадь пятна и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества. Применяется также прямоеспектрофотометрирование пластинки по спектрам отражения и по спектрам поглощения (фотоденситометрия), для количественных расчетов предварительно строят градуировочный график, используя оптическую плотность в центре пятна. Наиболее точным считается метод, когда анализируемое вещество удаляют с пластинки механическим путем или вымывают подходящим растворителем после вырезания зоны, а затем анализируют спектрофотометрическим, флуориметрическим, атомно-абсорбционным методами.

Метод ТСХ прост по методике выполнения и аппаратуре, экспрессен и не требует для анализа больших количеств вещества. Метод широко используется для идентификации компонентов лекарств, биохимических препаратов, неорганических веществ.

Бумажная хроматография

Вместо пластинок с нанесенным тонким слоем сорбента можно ис-пользовать специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок. Хроматографическая бумага должна быть химически чистой,

нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижной фазе и быть однородной по плотности; имеют значение структура молекул целлюлозы в бумаге, ориентация волокон и другие свойства, влияющие на скорость движения подвижной фазы. Основные операции в бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной.

Газовая хроматография

Газовая хроматография – это вариант хроматографии, в котором подвижной фазой является инертный газ (газ-носитель), протекающий через неподвижную фазу, обладающую большой поверхностью. Обычно в качестве подвижной фазы используют гелий, азот, аргон, водород, диоксид углерода или воздух. Газ-носитель должен быть инертным по отношению к разделяемым веществам и сорбенту, взрывобезопасным и достаточно чистым. Выбор газа-носителя в каждом конкретном случае должен обеспечивать соответствие его физических свойств получению высокой эффективности колонки и достаточной чувствительности детектора.

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая хроматография подразделяется на газоадсорбционную, когда неподвижной фазой является твердый адсорбент, и газожидкостную, когда неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на поверхность твердого носителя. В газовой хроматографии используется преимущественно элюентный(проявительный)способ проведения процесса хроматографирования .

Газовая хроматография – метод разделения летучих соединений. Этим методом можно проанализировать газообразные, жидкие и твердые вещества с молекулярной массой меньше 400, удовлетворяющие определенным требованиям, главные из которых – летучесть, термостабильность, инертность и легкость получения. Количественный анализ можно провести только в том случае, если вещество термостойко, т.е. испаряется в дозаторе воспроизводимо и элюируется из колонки без разложения. При разложении вещества на хроматограмме появляются ложные пики, относящиеся к продуктам разложения. Вещество не должно образовывать устойчивых сольватов при растворении в неподвижной жидкой фазе и реагировать с материалами, из которых изготовлены детали хроматографа. Этим требованиям удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому ГХ чаще используют как метод анализа органических соединений, хотя этим методом можно определять почти все элементы периодической системы в виде летучих соединений.

Характеристики удерживания

Если поток газа-носителя, содержащий десорбированноевеще-ство, проходит через чувствительный элемент прибора, фиксирующего мгновенное изменение концентрации вещества в газе (детектор), то на записывающем устройстве этого прибора получается кривая, называе-мая хроматографическим пиком или кривой элюирования.

На рисунке 1.6. изображена типичная кривая элюирования. По оси абсцисс отложен объем элюата (можно отложить время хроматографи-рования). Ее параметры, называемые характеристиками удерживания, могут служить средством идентификации компонентов разделяемой смеси.

Рис.1.6.

Лекция 8 Инструментальные методы исследования продуктов растительного и животного происхождения - student2.ru Кривая

проявительного анализа (хроматографический пик)

Время от момента ввода анализируемой пробы до регистрации максимума пика называют временем удерживания (элюирования) t_R (отрезок OG на графике). Время удерживания складывается из двух составляющих – времени пребывания вещества в подвижной и неподвижной фазах. Первое фактически равно времени прохождения через колонкунесорбируемого компонента (отрезок ОО^/ на графике). Значение t_R независит от количества пробы, но зависит от природы вещества и сорбента, скорости потока газа-носителя, а также упаковки сорбента и может меняться от колонки.

Качественный анализ

Качественными характеристиками хроматографируемых веществ в определенных условиях проведения опыта служат удерживаемый объем и время удерживания. Качественный анализ основан на измерении и сопоставлении этих величин. Существует несколько методов идентификации на основе характеристик удерживания.

Применение индивидуальных эталонных веществ.Один из ва-риантов этого метода состоит в последовательном разделении анализи-руемой и эталонной смесей в одинаковых условиях. Равенство временудерживания пиков соответствующих компонентов обеих смесей может служить основанием для идентификации.

Другой вариант заключается в том, что в исследуемую смесь вво-дят эталонный компонент, наличие которого в этой смеси предполагает-ся. Увеличение высоты соответствующего пика (без его расширения) по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до вве-дения эталона, может свидетельствовать о присутствии искомого соеди-нения в анализируемой смеси.

Указанный метод прост, но обладает существенными недостатка-ми. Во-первых, необходимо иметь эталонные вещества; во-вторых, все пики, полученные при разделении на данной колонке, должны соответ-ствовать индивидуальным веществам. Но даже при выполнении этих условий нет никаких гарантий однозначности проведенной идентификации. Практически всегда имеются по крайней мере два вещества, удерживаемые объемы которых на колонке с данным сорбентом достаточно близки.

Использование табличных данных о характеристиках удер-живания. В настоящее время опубликовано много таблиц со значения-

ми относительных удерживаемых объемов для самых различных ве-ществ. Эти таблицы можно использовать при отсутствии необходимых эталонных соединений. Анализируемую смесь разделяют на колонке при условиях, указанных в соответствующей таблице, причем предвари-тельно в смесь вводят небольшое количество веществ, служащих стан-дартами. На основе полученной хроматограммы рассчитывают относи-тельные удерживаемые объемы, индексы удерживания или другие ха-рактеристики. Полученные значения сравнивают с табличными данными.

Использование графических или аналитических зависимостей между характеристиками удерживания и другими физико-хи-мическими свойствами веществ.Известно, что логарифм удерживае-мого объема, lgVR, в пределахгомологического ряда веществ может коррелировать с такими свойствами, как число углеродных атомов в молекуле (z), температура кипения (Т) и т. д.

lgV_R=	a +bz	(1.15)
lgV_R=	a +bT	(1.16)

Соответствующие графики широко используют для идентификации компонентов анализируемых смесей. Если заранее известно, к какому гомологическому ряду принадлежит анализируемый компонент, то

определенная по графику температура кипения (или число атомов углерода) достаточна для индивидуальной идентификации.

Нехроматографические методы идентификации. Эффективным оказалось сочетание газовой хроматографии с другими методами исследования, например, с ИК-спектроскопией и масс-спектрометрией. По каталогу спектров или по эталонным веществам идентифицируют анализируемые вещества.

Возможно использование также методов ядерного магнитного резонанса, пламенной фотометрии и других, включая и химические методы (например, с применением химических реакций до и после хромато-графической колонки).

Количественный анализ

Количественный хроматографический анализ основан на измерении высоты или площади пика, зависящих от концентрации хроматографируемых веществ. Чаще всего для количественных расчетов измеряют площадь пика (S). Для измерения площадей пиков существует несколько приемов. Упрощенный метод состоит в умножении высоты пика (h) на его ширину, измеренную на расстоянии, равном половине высоты (w1/2). Этот метод очень распространен и достаточно точен. Егоприменение возможно при условии получения симметричных пиков и при полном разделении веществ.

Метод простой нормировки чаще всего используют на практике. Для его использования необходимо, чтобы на хроматограмме были зарегистрированы все компоненты, входящие в состав анализируемой смеси; сумму площадей всех пиков принимают за 100 %. Тогда отноше-ние площади одного пика к сумме площадей, умноженное на 100, будет характеризовать массовую долю (%) компонента в смеси.