Компоненты электрофореза в агарозном геле

Установка для электрофореза в агарозном геле.На рисунке 7 представлены основные элементы для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. Схематично, установку можно представить как емкость для электродного буфера, по краям которой расположены два электрода. В пространство между электродами заливается проводящий буфер, в котором проводится электрофорез, и помещают гель. При этом гель может быть залит непосредственно в камере, а может быть залит отдельно на специальном лотке, который помещается в камеру.

Агароза. Природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом, образованным повторяющимся элементом ‒ агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов: галактозы и 3,6-ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка, и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются преимущественно для разделения больших молекул.

Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс, плотность которого определяется концентрацией.

Буфер для электрофореза. На электрофоретическую подвижность ДНК воздействуют состав и ионная сила буфера для электрофореза. В отсутствии ионов, электропроводность минимальна, и перемещение ДНК происходит медленно. В буфере с высокой ионной силой электропроводность очень эффективна, и образуется значительное количество тепла. В худшем случае, гель расплавляется и ДНК денатурирует. Существует несколько буферов для электрофореза нативной двухцепочечной ДНК. Они содержат ЕОТА (рН 8,0) и Тгis-ацетат (ТАЕ), Тгis-борат (ТВЕ), или Тгis-фосфат (ТРЕ).

Маркерная ДНК. При заданном напряжении, концентрации агарозного геля и буфера, расстояние перемещения зависит от молекулярного веса исходного материала. Поэтому, маркерная ДНК известного размера должна наноситься на дорожки и с левого, и с правого края геля. Маркер обычно содержит определенный набор известных сегментов ДНК, которые облегчают определение размера исследуемой ДНК, если какое-либо систематическое искривление геля возникнет во время электрофореза.

Буфер для нанесения. Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие).

Окраска и фиксация

Для анализа результатов электрофореза, после его завершения, требуется, прежде всего, визуализовать картину распределения полос в геле. С этой целью могут применяться два основных подхода. Первый способ состоит в окрашивании ДНК специфическими красителями. Для этой цели существует большое разнообразие красителей, способных специфически окрашивать двунитевые или однонитевые участки ДНК, ДНК в составе различных комплексов или в определённой конформации. К достоинствам такого подхода можно отнести высокую чувствительность, избирательность окрашивания и дешевизну метода. Среди недостатков можно упомянуть относительную трудоёмкость процедуры, невозможность следить за ходом электрофореза в реальном времени, токсичность некоторых из широко применяемых красителей, воздействие красителей на структуру ДНК, и необходимую иногда предварительную фиксацию ДНК в геле.

Другой путь основан на способности самой ДНК поглощать свет в УФ диапазоне. Поэтому можно просканировать гель в УФ-свете и определить местоположение ДНК в геле. В настоящее время промышленностью выпускаются специальные комплексы, позволяющие следить за миграцией ДНК в геле в автоматическом режиме непосредственно в ходе электрофореза и получать оцифрованное изображение в любой момент времени. При использовании этого подхода предварительная фиксация ДНК в геле не требуется. К недостаткам подхода можно отнести малую избирательность метода и относительную дороговизну оборудования.

Наиболее распространенным красителем ДНК в экспериментах по электрофорезу является бромистый этидий. Этот краситель относится к соединениям, способным интеркалировать между парами оснований ДНК. Вещество является сильным канцерогеном и мутагеном, способным проникать через кожу. По этой причине работа с ним требует особой осторожности и соблюдения повышенных мер безопасности. При работе с бромистым этидием всегда необходимо использовать перчатки и маску. Отходы, содержащие бромистый этидий, требуют специальной утилизации.

ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ

1. Для приготовления 1%-го геля ‒ смешайте 100 мл воды и 1 г агарозы и доведите раствор до кипения. Размешайте до ресуспендирования осевшей агарозы. В пластиковую кювету для геля установите гребенку под будущие лунки. Влейте агарозу в кювету. Агароза должна заполнить куветю полностью. Когда гель затвердеет, осторожно удалите гребенку.

2. Готовим камеру ‒ кладем пластиковую кювету с гелем в камеру, заливаем буфером так, чтобы гель скрылся под ним.

3. Вносим 5–10 мкл образца в лунки и закрываем верхней крышкой.

4. К черному штекеру присоединяем отрицательный полюс, а к красному положительный.

5. Включаем форез ‒ 120 В 20–30 мин. Возле электродов должны быть небольшие пузырьки, как индикатор, что форез пошел. ДНК двигается от минуса к плюсу, поэтому лунки с ДНК должны быть возле черного штекера (минуса).

6. Через 20–30 мин, выключаем прибор, открываем крышку и вытаскиваем кувету с гелем шипцапи или используем перчатки. В случае наличия в образце красителя, разделение можно будет увидеть невооруженным глазом, а при его отсутствии просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют.

ОТЧЕТ

Сделать вывод о проделанной работе. Зарисовать электрофореграмму.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Дайте понятие электрофорезу.

2. Дайте понятие электрофорезу в агарозном геле.

3. Физические принципы электрофореза в агарозном геле.

4. Перечислите параметры, от которых зависит движение заряженных частиц в агарозном геле.

5. Перечислите компоненты, необходимые для электрофореза в агарозном геле.

6. Основные элементы установки для электрофореза в агарозном геле.

7. Объясните методы анализа результатов электрофореза, их достоинства и недостатки.

8. К какому полюсу происходит движение молекул ДНК при электрофорезе в агарозном геле и почему?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3