Опыт 3. Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на полиакриламидном геле
Материалы и оборудование: прибор для проведения электрофореза на полиакриламидных гелях «VE-1» с блоком питания «Эльф-2», ТЕМЕД, персульфат аммония, 0,5%-й раствор амидового черного 10 Б в 7%-й СН3СООН, 0,1%-й раствор красителя Кумасси R-250 на 7%-м растворе СН3СООН, 7%-й раствор СН3СООН, 40%-й раствор сахарозы, 1 н раствор НС1, трис, глицин, акриламид, N,N-метиленбисакриламид, водный раствор метиленового синего (1 мг на 100 мл), 1%-й раствор агарозы на буферном растворе для приготовления геля (см. ниже), сыворотка крови.
Ход работы
Для приготовления электродного буферного раствора (рН 8,3)6,0 г триса и 28,8 г глицина растворить в воде, объем довести до 1,0 л дистиллированной водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике. При использовании в работе основной раствор разбавляют в 10 раз.
Для приготовления буферного раствора для приготовления геля (рН 8,9) к 36,3 г триса добавить 48 мл 1 н раствора НС1, объем довести водой до 100 мл.
Для приготовления маточного раствора акриламида28 г акриламида и 0,735 г N,N-метиленбисакриламида растворить в 100 мл воды (сначала растворить метиленбисакриламид, затем акриламид). Акриламид токсичен – работу проводить в резиновых перчатках!
Перед началом работы необходимо внимательно ознакомиться с инструкциями по эксплуатации камеры для электрофореза «VE-1» и источника питания «Эльф-2»!
Приготовление полакриламидных пластинок и проведение электрофореза.Для герметизации слэба к одной стороне электрофоретической ячейки пружинными зажимами прижать пакет, состоящий из двух стекол (внутреннее стекло с верхней прорезью), между которыми по вертикальным краям пакета зажаты спейсоры. К другой стороны ячейки прижать такой же пакет (если электрофорез проводится одновременно на двух пластинах) или заглушку (если проводится на одной пластине).
Собранную ячейку вставить в электрофоретическую камеру «VE-1», чтобы убедиться в правильности ее сборки. Если ячейка без усилий не входит в камеру, при ее сборке допущены ошибки.
На специальные риски горизонтально установленной заливочной пластины нанести одну или две полосы расплавленной агарозы шириной примерно 6 мм. Не допуская застывания агарозного геля, ячейку с пакетом стекол устанавить на заливочную пластину таким образом, чтобы нижняя щель пакета стояла в расплавленном геле. Специальной пипеткой нанести расплавленную агарозу на внутреннюю поверхность боковых граней пакета. После застывания агарозы в зазор между стеклами залить смесь для полимеризации, которая готовится непосредственно перед использованием.
Для получения 10 мл 7%-го геля в щелочной буферной системесмешать 1,25 мл буферного раствора для приготовления геля (рН 8,9); 2,5 мл раствора акриламида; 0,005 мл ТЕМЕД; 1,0 мл свежеприготовленного 0,1%-го раствора персульфата аммония. Объем смеси довести дистиллированной водой до 10 мл.
Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Для заполнения одного слэба на приборе «VE-1» требуется около 10 мл смеси.
В данной работе разделение проводят в геле только одного типа, поэтому раствор залить в пакет доверху и сразу же между стеклами вставить специальную пластинку — «гребенку»[1]. Зубцы ее образуют углубления на поверхности геля, в которые впоследствии вносят образцы белка.
После окончания полимеризации вынуть из геля шаблон-гребенку и вставить ячейку в прибор. Контакт между электродными отсеками в приборе (они расположены с двух сторон от гелевой ячейки) осуществляется через пластинку полиакриламида, верхний конец которой контактирует с верхним электродным отсеком, а нижний конец — с нижним электродным отсеком. После сборки прибора электродные камеры заполнить буферным раствором, а в лунки-колодцы на поверхности геля тонко оттянутым капилляром из стекла или из тефлоновой или полиэтиленовой трубочки нанести образцы белка. Необходимо, чтобы плотность образцов белка была выше плотности буферного раствора. Поэтому раствор белка готовят на 10%-м растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключить к источнику тока и провести электрофорез. После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключить, слить электродные буферы и вынуть гелевую ячейку. С ячейки снять пружинные зажимы, аккуратно отделить одно стекло от другого и перенести пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку с раствором красителя амидового черного 10 Б. Время окрашивания 5-10 мин. В качестве красителя можно использовать кумасси R-250. В этом случае прокрашивать 1-2 ч при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмыть 7%-м раствором уксусной кислоты. Окрашенные пластины геля сохранять в том же растворе кислоты.
Лабораторная работа №3.2
Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы методом электрофореза в полиакриламидном геле
После разделения белков сыворотки крови методом электрофореза в столбиках полиакриламидного геля производят выявление фракций лактатдегидрогеназы специальными красителями. В норме имеет место следующее распределение изоферментов: ЛДГ1 - 31,3%, ЛДГ2 - 46,5%, ЛДГ3 - 11,3%, ЛДГ4 - 4,6%, ЛДГ5 - 4,1%.
Материалы и оборудование: прибор для проведения электрофореза в столбиках полиакриламидного геля «Reanal» с блоком питания; термостат; спектрофотометр или фотоколориметр; ТЕМЕД; персульфат аммония; 40%-й раствор сахарозы; 1 н раствор НС1; трис; глицин; акриламид; N,N-метиленбисакриламид; водный раствор метиленового синего (1 мг на 100 мл) ; лактат лития; НАД;р-нитротетразолевый синий (НТС);феназинметасульфат (ФМС); NaCl; MgCl2; 0,5 М фосфатный буферный раствор рН 7,4; кислота уксусная, диметилформамид; сыворотка крови.
Ход работы
Для приготовления электродного буферного раствора (рН 8,3)6,0 г триса и 28,8 г глицина растворить в воде, объем довести до 1 л дистиллированной водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике. При использовании в работе основной раствор разбавлять водой в 10 раз.
Для приготовления буферного раствора для приготовления геля (рН 8,9) к 36,3 г триса добавить 48 мл 1 н раствора НС1, объем довести водой до 100 мл.
Для приготовления маточного раствора акриламида60 г акриламида и 0,4 г N,N-метиленбисакриламида растворить в 100 мл воды (сначала растворить метиленбисакриламид, затем акриламид). Акриламид токсичен – работу проводить в резиновых перчатках!
Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки зафиксировать на специальной подставке из оргстекла. Герметичность сборки проверяется заранее, до заполнения их гелем.
Для получения 100 мл 5%-го геля в щелочной буферной системесмешать 12,5 мл буферного раствора для приготовления геля (рН 8,9); 25 мл раствора акриламида; 1,0 мл ТЕМЕД; довести объем водой до 50 мл и добавить 50 мл свежеприготовленного 0,28%-го раствора персульфата аммония.
Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Если используют, например, 12 трубочек, нужно приготовить 30 мл смеси. Осторожным вращением колбочки раствор перемешать и внести пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1-1,5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслоить воду (0,2-0,3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через 20-40 мин, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду слить, удалить ее остатки фильтровальной бумагой. Трубочки снять с подставки и ввинтить в отверстия дна верхнего буферного резервуара (рис. 10, 1). Верхний резервуар присоединить к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором. Следить за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха.
На столбик полиакриламидного геля нанести сыворотку, разведенную раствором сахарозы (на 1 часть сыворотки — 2 части раствора сахарозы, 400 г/л). На различные трубочки нанести различные объемы пробы: 10, 20, 40 и 80 мкл.
После нанесения образцов белка в трубочки наслоить электродный буферный раствор, затем залить буфер в верхний резервуар. При использовании щелочных буферных растворов в них добавить раствор бром-фенолового синего из расчета 0,5-1 мл красителя на 500 мл раствора. Краситель маркирует движущийся пограничный слой во время электрофореза.
В первые 5-10 мин электрофорез проводить при силе тока 4-5 мА на трубочку, затем силу тока увеличить до 25 мА. Электрофорез заканчивают, когда окрашенная полоса достигнет нижнего конца трубочки (для этого требуется около 90 мин).
После завершения электрофореза прибор отключить от источника тока, слить буферный раствор. Трубочки вынуть из прибора и с помощью стальной иглы (под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, вытолкнуть столбик геля и поместить его в инкубационную среду (красящую смесь). Эту, смесь готовить согласно следующей таблице:
| Компоненты смеси | Объем компонента при окраске…, мл | ||
| 6 трубочек | 9 трубочек | 12 трубочек | |
| 1 М раствор лактата лития | 4,0 | 6,0 | 8,0 |
| Раствор НАД (20 мг/мл) | 2,0 | 3,0 | 4,0 |
| 0,1 М раствор NaСl | 4,0 | 6,0 | 8,0 |
| 0,005 М раствор MgCl2 | 4,0 | 6,0 | 8,0 |
| 0,5 М фосфатный буфер рН 7,4 | 5,0 | 7,5 | 10,0 |
| Раствор НТС (1 мг/мл) | 10,0 | 15,0 | 20,0 |
Выдержать смесь 15 мин при температуре 37°С
| Раствор ФМС (1 мг/мл) | 1,0 | 1,5 | 2,0 |
| Общий объем смеси | 30,0 | 45,0 | 60,0 |
Каждый столбик полиакриламидного геля поместить в отдельную пробирку, залить инкубационной средой и выдержать в термостате при температуре 370С в течение одного часа. Затем столбики геля обмыть водой и перенести в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты (75 г/л).
Зарисовать распределение изоферментов ЛДГ.
Для количественного определения относительной активности различных изоферментов ЛДГ столбики разрезать на участки, содержащие по одному изоферменту. Поместить кусочки геля в пробирки с подогретым до 80—850С раствором диметилформамида (100 г/л) и инкубировать при той же температуре до полного перехода красителя из геля в растворитель. После охлаждения элюентов до комнатной температуры определить оптическую плотность элюентов на фотоколориметре. Относительную активность изоферментов выразить в процентах от суммы, полученной после сложения величин оптической плотности всех изоферментов ЛДГ.
Контрольные вопросы
14. Какие характеристики белка определяют его электрофоре6тическую подвижность?
15. С чем связана необходимость использования при электрофорезе поддерживающих сред?
16. Как влияет на результаты электрофореза явление обратного электроэндоосмоса?
17. Сравните преимущества и недостатки электрофореза в агарозных и полиакриламидных гелях.
18. Преимущества и недостатки установок для вертикального электрофореза.
19. Принцип, достоинства и недостатки диск-электрофореза.
20. Каким образом можно оценить молекулярную массу белка методом электрофореза?
21. Какой электрофоретический метод вы используете для оценки степени очистки белка?
22. Для какой цели при электрофорезе по Laemmli в исследуемую пробу добавляют додецилсульфат натрия?
23. Для какой цели при электрофорезе по Laemmli в исследуемую пробу добавляют меркаптоэтанол?
ЛИТЕРАТУРА
1. Остерман Л.А.Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Пособие для студентов. - М.: МЦНМО, 2002.
2. Скоупс Р. Методы очистки белков. М., 1985.
3. Виноградова Р.П., Цудзевич Б.А., Храпунов Б.А. Физико-химические методы в биохимии. – Киев, Вища Школа. Головное из-во, 1983. – 287 с.
4. Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биомолекул. Пер. с англ. М., Мир, 1982, 446 с.
5. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.
ТЕМА 4. ХРОМАТОГРАФИЯ
Общая черта всех хроматографических методов: существование двухфазной системы, в которой одна фаза неподвижна, другая - перемещается относительно первой с некоторой скоростью в определенном направлении. Неподвижная фаза остается неизменной, заполняя полость трубки (хроматографической колонки) или фиксируясь на поверхности пластинки. Подвижная фаза постоянно обновляется, поступая с одного конца системы и покидая ее с другого. Процесс пропускания подвижной фазы называют элюированием, а саму подвижную фазу – элюентом. Молекулы исходной смеси распределяются между фазами в соответствии со степенью своего сродства к ним. На каждом участке неподвижной фазы это распределение стремится к состоянию динамического равновесия, которое постоянно нарушается движением подвижной фазы. В результате постоянного перераспределения вещества между фазами они мигрируют в направлении движения подвижной фазы, причем скорость тем больше, чем меньше сродство к неподвижной фазе. Если на колонку исходно нанести смесь двух веществ с различным сродством, то они будут мигрировать с разной скоростью, вследствие чего произойдет их физическое разделение.
Неподвижная фаза может быть твердой или жидкой. Подвижная - жидкой или газообразной, в соответствии с чем хроматографию называют жидкостной или газовой. Хотя в биохимии нашли применение оба этих типа хроматографии, наибольшее распространение, безусловно, получила жидкостная.
По механизмам разделения хроматографию подразделяют на адсорбционную (газовую или жидкостную), ионообменную, распределительную, гель-фильтрационную (гель-хроматографию) и биоспецифическую (аффинную); по форме хроматографического канала — на колоночную, хроматографию на бумаге и в тонком слое. Для фракционирования белков применяется главным образом хроматография на колонках.