Дезоксирибонуклеиновые кислоты

Первичная структура ДНК.

ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичную структуру. Определение первичной структуры ДНК оказалось крайне сложной и трудной задачей, так как размеры молекулы огромны, а нуклеотиды бывают всего четырех видов. Больших успехов в изучении структуры ДНК достигли Э. Чаргафф и сотрудники его лаборатории, которые, используя метод хроматографии, впервые (1950) определили нуклеотидный состав ДНК, выделенной из разных объектов. Они установили, что соотношение в ДНК азотистых оснований подчиняется универсальным закономерностям, которые получили название правила Чаргаффа.

Эти исследования на огромном экспериментальном материале показали, что внутри ряда систематических групп нуклеотидный состав ДНК специфичен для каждого вида. Установлено, что у большинства животных преобладает АТ-тип строения ДНК. У бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильно выраженного ГЦ-типа до АТ-типа. Нуклеотидный состав ДНК бактерий используют в настоящее время как один из систематических признаков в исследованиях по таксономии. Этот признак позволяет уточнять родство отдельных бактериальных видов, решать спорные вопросы классификации. Однако даже при одинаковом количественном соотношении А, Т, Г, Ц строение ДНК может быть различным, поскольку оно обусловлено также последовательностью расположения нуклеотидов.

Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух антипараллельньгх полинуклеотидных цепей. Это заключение явилось результатом большого числа экспериментальных данных и первичных обобщений. К ним относятся работы. Э. Чаргаффа и его сотрудников, которые показали, что нуклеотидный состав ДНК жестко сбалансирован. Они свидетельствуют о том, что полинуклеотидная цепь ДНК расположена в форме спирали с периодом идентичности (шагом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм. Физико-химическими исследованиями было установлено, что в молекуле ДНК между амино- и кетогруппами азотистых оснований образуются водородные связи.

Рис. 6. Спаривание аденина с тимином и гуанина с цитозином в молекуле ДНК.

водородные связи показаны пунктиром

Расстояния между гликозидными связями одинаковы для каждой пары нуклеотидов— 1,085 нм. Цепи ДНК направлены противоположно друг другу, т. е. антипараллелъны. Стабильность двойной спирали определяется в основном взаимодействием расположенных друг над другом, как стопка монет, азотистых оснований. Расстояние между плоскостями оснований (0,34 нм) примерно эквивалентно сумме ван-дер-ваальсовых радиусов ароматических колец. При этом создаются условия для возникновения особого рода ван-дер-ваальсовых сил — стэкинг-взаимодействий.

4.3.Физико-химические свойства ДНК.Хромосомы животных, бактерий, вирусов содержат по одной непрерывной ДНК-спирали огромной длины по сравнению с размерами ядра (табл. 7).

Таблица 7. Размер различных молекул ДНК (по В. А. Ратнеру)

Объект	Длина хеликса, мкм	Размер, кб1	Форма
Онкогенный вирус SV40 Фаг ΨХ174 Фаг λ Хромосома E.coli Хромосомы дрожжей Х-Хромосома дрозофилы Средняя хромосома мыши	1,7 1,8 17,0 50—750 1042 3,4×104	5,2 5,5 48,0 (2—3) ×103 1,5х102— 2,2×103 З×104 11,З×104	Двухцепочечная кольцевая Одноцепочечная Двухцепочечная линейная

Молекулярная масса ДНК определена с помощьюряда методов. Классический метод ультрацентрифугирования позволяет определять размеры ДНК в пределах М = 2×10⁵ — 1×10⁹. Более длинные молекулы разрываются ДНК. при ультрацентрифугировании, поэтому их молекулярную массу определяют по вязкости.

Все внешние факторы, которые нарушают водородные связи или ослабляют стэкинг-взаимодействия, вызывают денатурацию ДНК. К ним относятся реагенты, подобные формамиду и мочевине, резкое изменение рН и ионной силы раствора повышение температуры выше 80°С. Денатурация ДНК — это любые изменения пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Обычно при денатурации происходит нарушение водородных связей, или стэкинг-взаимодействий, или тех и других. Двойная спираль ДНК при этом полностью или частично разделяется на составляющие ее цепи.

Полная денатурация ДНК — это расхождение комплементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако если охлаждение проводить медленно, поддерживая в течение некоторого времени температуру немного ниже ТПл (этот прием называют отжигом), может восстановиться нативная структура. Восстановление первоначальной структуры нуклеиновой кислоты с более или менее полным восстановлением физических показателей и биологических свойств получило название ренатурации. Это процесс, противоположный денатурации.

Резкое подкисление или подщелачивание разрушает двухспиральную структуру ДНК, так как изменяется ионизация амино- и кетогрупп азотистых оснований, вследствие чего разрываются водородные связи. Растворы нативной ДНК оптически активны, обладают сильным правым вращением поляризованного света, которое уменьшается при денатурации.

Денатурация и ренатурация ДНК непрерывно протекают в клетке в процессе репликации ДНК, в процессе транскрипции. Проведение их в лаборатории позволяет изучать многие свойства молекул ДНК.

Третичная структура ДНК бактерий и вирусов.В частицах вирусов, клетках бактерий, как и в ядрах высших организмов, ДНК плотно «упакована», образует сложные структуры. Например, в хромосоме Е.сoli содержится ДНК длиной более 1 мм, хотя длина клетки не превышает 5 мкм. Одна из самых мелких молекул ДНК — вирусная, однако если ее вытянуть, то она будет во много раз длиннее, чем сам вирус

Цитоплазматическая ДНК. В цитоплазме эукариот содержится небольшое количество ДНК (менее 1% всей ДНК клетки). Она получила название цитоплазматической и отличается от ядерной ДНК по нуклеотидному составу и молекулярной массе. Заключенная в ней генетическая информация обусловливает цитоплазматическую наследственность. Цитоплазматические гены находятся в митохондриях и хлоропластах.

Наиболее полно изучена митохондриальная ДНК (мтДНК). В клетках животных она представлена двухцепочечными, обычно кольцевыми молекулами, длиной по окружности от 5 до 30 мкм. Молекулярная масса мтДНК у дрожжей, грибов, простейших (3—4) × 107, у высших животных до 107. В одной митохондрии может содержаться от 2 до 10 молекул ДНК, обычно они находятся в матриксе.

Все гены в мтДНК млекопитающих расположены исключительно компактно, почти без промежуточных нуклеотидных последовательностей, в то же время в дрожжевой мтДНК между генами находятся повторяющиеся некодирующие участки. МтДНК кодирует две рРНК митохондриальных рибосом, полный набор тРНК, необходимых для синтеза белка, и ограниченное число полипептидов, синтезируемых на полисомах в митохондриях. Полипептиды представляют собой субъединицы ферментативных комплексов внутренней мембраны митохондрий. Например, митохондриальную природу имеют в зависимости от объекта одна, две, а у дрожжей — три субъединицы АТФ-синтетазного комплекса, три субъединицы цитохромоксидазы и апофермент цитохрома 6. Остальные субъединицы этих комплексов кодируются ядерными генами и синтезируются в цитоплазме.

Бактериальные плазмиды. В цитоплазме многих бактерий кроме хромосомной ДНК содержатся добавочные маленькие кольцевые молекулы ДНК, присутствие которых необязательно для жизни клетки. Они получили название плазмид. Плазмиды способны автономно размножаться, стабильно наследуются, т. е. сохраняются без специальной селекции во внехромосомном состоянии. Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому бактерии, они называются эписомами.

Плазмиды обладают как общими, так и специальными функциями. Всем плазмидам свойственна, например, способность к автономной репликации, а также свойство несовместимости (две близкородственные плазмиды не могут существовать в одной клетке).

Биологическая роль плазмид велика: они обеспечивают бактериям селективные преимущества в меняющихся условиях внешней среды. Благодаря способности к переносу и автономной репликации плазмиды широко используются в генетической инженерии.

Кроме бактерий, плазмиды иногда содержат синезеленые водоросли, а из эукариотических организмов — дрожжи.